Ada E. Yonath教授
科学活动
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Ada E. Yonath教授 |
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核糖体:分子，结构，功能，进化，医学和遗传方面
我们关注核糖体功能的主要方面的分子和结构基础，它们的抑制(主要是抗生素)，它们的起源(它提供了基于RNA的世界和当代生活之间的联系)。与此同时，我们正在设计下一代环保抗生素，以及用于可控蛋白合成的重组胶原- mrna平台，同时研究核糖体病，即与核糖体基因突变有关的人类疾病，主要是癌症和严重贫血。
背景
核糖体是催化遗传密码翻译成蛋白质的细胞器。它是一种蛋白质/RNA组合，排列在两个亚基中，进行蛋白质生物合成。大亚基创造肽键，并为新生蛋白质的出现提供路径，而小亚基在启动生物合成过程和控制密码子-反密码子碱基配对的保真度方面起着关键作用。核糖体包含三个tRNA结合位点，分别为A(氨基酰基)、P(肽基)和E(出口)，它们分别位于两个亚基上。在延伸周期中，两个核糖体亚基一起工作，通过精确的一个密码子将所有三个tRNAs分子与相关的mRNA链一起移位。在这个运动中，每个tRNA分子通过三个核糖体结合位点，从A-到p -到e -位点。
历史
大约30年前，我们开始研究核糖体晶体学，(Yonath et al. 1980)，并于2000年和2001年测定了小核糖体亚基和大核糖体亚基功能活性构象的3a结构(图1-2和Schluenzen等人，2000，Harms et al.， 2001，Schluenzen等人，2004，Auerbach等，2004年，Yonath和Bashan 2004年，Harms等人，20042005年阿,Pfister等，2005，Yonath等，2009，Bashan等，2010，Bashan和Yonath 2011年，Belousoff et al . 2011，齐默尔曼等，2014，Eyal等，2015，Matzov等，2017b，Belousoff et al 2017，Eyal等人2016年，Krupkin等人2016进一步的分析揭示了肽键形成的机制，阐明了核糖体参与细胞调节的方式。此外，通过对十几种抗生素结合模式的晶体学研究，阐明了它们作用的结构基础和选择性，并阐明了致病菌获得耐药性的可能途径。我们的研究结果重点如下所述。
下一代环保抗生素
抗生素耐药性是当代医学中的一个严重问题。在确定了靶向细菌核糖体的抗生素作用模式的共同特征后，这些抗生素阐明了上述抗生素抑制作用的共同途径(即与核糖体功能位点结合)，为了阐明传染病易感性的物种特异性多样性，我们确定了多重耐药致病菌的核糖体结构。仔细比较致病性细菌和非致病性细菌的结构发现了新的结构基序，这些结构基序对蛋白质生物合成至关重要，但并不位于主要核糖体活性位点，因此目前还不知道它们的修饰机制可能导致耐药性。因此，预计耐药性出现的速度较慢，效率较低。这些发现促使人们设计出具有理想成分的抗生素，这些成分可以在化学性质、毒性、细胞穿透性和物种特异性方面进行优化，从而保护微生物组(当前抗生素无意中破坏了微生物组)，并提高其生物降解性，从而减少当前抗生素代谢产物中不可消化成分造成的生态危害。Matzov et al 2017a，Auerbach-Nevo等人2016
图1:真细菌的两个核糖体亚基的a3结构，从它们的“正面”来看，即在组装的70S核糖体中创建亚基间界面的表面。银色丝带代表核糖体RNA，而核糖体蛋白质的主链则用不同的颜色绘制。正确的:小核糖体亚单位栖热菌属酸奶(T30S)。朝向:“鼻子”和“肩膀”在左边，“平台”在右边。A、P、E分别表示三个tRNA分子的反密码子环。左:大的核糖体亚单位耐辐射球菌(D50S)。朝向:L7/L12茎在右边，L1茎在左边。A、P和E(氨基酰基、肽基和出口)分别表示三种tRNA分子弯头与大亚基相互作用的位点。插入:一种tRNA分子(金色)及其在核糖体上的近似位置。标记了两个功能相关的特征，即反密码子环和通用氨基酰化的CCA端。
FIGURE2：
RNA的主干代表(左)选择的蛋白质(右)大核糖体亚单位的Dienococcus耐辐射奇球菌．
A.肽键形成
通过对大核糖体亚基与各种底物类似物、抗生素和抑制剂配合物的晶体学研究，证实核糖体的主要催化任务是为tRNA分子的精确定位提供模板，而不是参与实际的化学反应。在所有已知核糖体结构的肽基转移酶中心发现了一个双重旋转轴，从而提出了肽键形成、易位和新生蛋白进展的统一机制。这种机制意味着核糖体不仅将底物定位在有利于肽键形成的方向上，它还引导易位并保证其准确性。来自大核糖体亚基的高分辨率晶体结构耐辐射球菌与tRNA-mimics复合物(Harms et al.， 2001；Bashan et al.， 2003；Agmon等人，2003年；Agmon等人，2005年)表明，精确的底物定位是有效蛋白质生物合成所必需的，是由tRNA螺旋特征的远程相互作用决定的。事实上，精确定位的模拟物和定位不准确的模拟物的叠加表明它们的结合模式存在显著差异(图3)。因此，没有进行远程相互作用的模拟物或由于精确定位所涉及的特征的混乱而有些错位的模拟物被定位在肽基转移酶中心(PTC)，其构象需要重排(Hansen等人，Mol Cell, 10,117 -128, 2002)。进一步的分析揭示了两个分子开关:螺旋H69似乎在tRNA受体茎的a -到P-通道中充当“起重机”(图4A和B)，碱基A2602似乎充当螺旋桨(图4C和D)。我们提出了一个统一的机制，整合了肽键的形成，a - p位点的易位，以及新生蛋白进入其出口通道。该提议基于PTC的结构，tRNA模拟物的放置，以及核糖体RNA的近200个核苷酸(超过90个核苷酸偶)的双重相关区域的鉴定(图5A)，以及a -和p -位点模拟物在大核糖体亚基中的相对取向Haloarcula marismortui， H50S (Nissen等，科学289,905- 920,2000;Schmeing等，NSB 9,225 - 30,2002;Hansen等，Mol Cell, 10, 117-128, 2002)。这种机制意味着肽键的形成与tRNA 3'末端的主要(尽管相关)运动结合在一起，并涉及a -site-tRNA 3'端围绕一个近似两倍旋转轴的螺旋旋转，该旋转轴与单链3'端和a -site tRNA的螺旋受体茎之间的键重叠。该机制的唯一要求是初始p位点tRNA具有旋转构象。PTC特征确保了a位点对p位点羰基碳的亲核攻击所需的精确方向，指导旋转运动(图5A-E)。在所有已知的大核糖体亚基结构中检测到相似的双重对称相关区域，表明了我们提出的机制的普遍性。
蛋白质伸长的连续性的几何要求是所有a位点的tRNA都被精确定位，以便它们能够进行旋转运动，并且第一个p位点的tRNA被定位为所谓的“翻转”构型。后者的方向性是由于PTC在p位点提供了2个潜在的碱基对(图5F)，而不是在a位点提供了一个碱基对。重要的是，这两个p位点碱基对允许p位点tRNA的A76为肽键的形成提供化学催化(Weinger et al.， Nat Struct Mol Biol 11,1101 - 6,2004)。
B.核糖体进化整个对称区域高度保守，与它的重要功能一致。对称区域的普遍性提示核糖体活性位点是由两个具有相似结构的独立结构域的基因融合进化而来的，每个结构域拥有一半的催化活性。重要的是，尽管核糖体内部对称将核苷酸取向和RNA主干折叠联系起来，但相关核苷酸之间没有序列同一性。无论序列如何，核糖体框架的两半的三维结构的保存表明了在立体化学支持肽键形成中精确的底物定位的严格要求。同样，蛋白质L16，唯一有助于tRNA定位的核糖体蛋白质(Agmon等人，2003年；Bashan et al.， 2003)，显示保守的三级结构和发散的一级序列(图5A)。
尽管古代核糖体似乎仅由RNA构建，并且/或后来添加了蛋白质以保持RNA的完整结构，但其中一些蛋白质直接有助于底物定位和反应过程。
蛋白质L2对核糖体聚合酶活性的贡献也可能有助于核糖体进化。蛋白质L2是唯一一个同时与A-和p区相互作用的蛋白质(图5G和在Agmon等人，2005年)，在参与这些相互作用的两个残基中，其中一个残基(229)被证明对新生链的延长至关重要(Cooperman et al.， Biochem Cell Biol 73, 1087- 94,1995)。因此，L2的主要功能似乎是在伸长发生时为PTC提供稳定。核糖体框架的稳定对于维持准确的底物定位是必需的，对于使旋转运动是必需的，但与单肽键的形成无关。这一发现与一种假设是一致的，即古代核糖体仅以RNA的形式产生，蛋白质是后来添加的，以提高其保真度和效率。
参与维持对称区域结构，从而参与肽基转移酶活性也可归因于蛋白质L36。这个含有Zn的小蛋白质(图5G)位于四个平行螺旋的中间，似乎稳定了它们的整体构象。其中两个螺旋是对称相关区域的一部分，两个是PTC主部件的非对称扩展。此外，在其位置，L36相互作用也可以将这些螺旋与延伸因子结合位点连接起来。因此，除了稳定对称相关区域的构象外，它还可能参与传递有关因子结合的信息。可能存在其他信号通路和/或构象保存的替代方法，这可能解释了L36在某些物种中缺失的原因，例如h . marismortui．
对称相关区域直接或通过其延伸连接蛋白质生物合成所涉及的所有核糖体特征(图5H)。因此可以作为它们之间的过渡信号的中心。Krupkin等人2014，Huang等，2013，Fox et al 2012，Krupkin等人，2011，Belousoff et al . 2011，Bashan等，2010，Davidovich等，2010，Belousoff et al . 2010，马萨等2010年，Davidovich et al, 2009，Agmon等，2005，Zarivach等，2004．
数字3：
PTC的特点决定了基片在有源位置的精确定位。在晶体学上确定的35聚寡核苷酸的位置，模仿氨基酰化tRNA受体茎显示为红色(Bashan et al.， 2003)．停靠的A-和p -位点tRNA(使用T70S复合体的结构，Yusupov等人，Science, 292883 -896, 2001)分别以青色和橄榄绿的带状显示。插入表示当远程触点不可用时基片精确定位的偏差，要么是因为基片模拟物很短(蓝色)，要么是因为决定定位的主要特征之一H69是无序的(绿色)(Nissen等人，Science 289, 905- 920,2000)。
螺旋H69在A位点tRNA受体茎向p位点易位中的作用的动态表达。
作为“起重机”的螺旋H69 (前)或“弹簧”(底)用于将tRNA受体从A-(青色)位点转位到P-(橄榄绿)位点。受体茎模拟物(Bashan et al.， 2003)以红色显示。螺旋H44(浅绿色)代表小亚基。A2602在大亚基功能复合物中观察到的不同构象。D50S的复合物是:ASM，一个35个核苷酸的tRNA受体茎模拟物;ACCP: ACC与嘌呤霉素结合;石膏:司帕霉素;凸轮;氯霉素(Bashan et al.， 2003；Schluenzen等人，2001年)．大核糖体亚基的复合体Haloarcula marismortui(H50S)具有短(或部分无序)tRNA模拟物:1FG0 (Nissen等人，Science 289, 920- 30,2000)和1KQS (Schmeing等人，NSB 9,225 - 30,2002)。突出显示的是sparsomycin和氯霉素的位置。PTC元素以灰色显示。浅:D50S与氯霉素配合物结构为深灰色，与疏霉素配合物结构为浅灰色。
图4 c:
A2602构象重排的动态表示。
如图所示，tRNA受体茎模拟ASM，不存在(红色)和存在(粉红色)sparsomycin(金色)。PTC中的RNA骨干是灰色的。A2602是基地。另见Bashan等人，2003年和E节。
FIGURE5:
左：在所有已知的大核糖体亚基结构中检测到相当大的对称相关区域(红点表示两倍旋转轴的大致位置)。
右::进入活动部位的视图，显示了对称相关区域的内壳(在右下角的面板中)。A点和p点的大致位置标记在左边。核苷酸在右边编号。对称相关的核苷酸颜色相同。核苷酸A2602的颜色不同(金色和银色)，打破了对称性，在易位和a ->P传代中具有特殊作用(也见图4)。
底部:左:对称相关区域的二维图，分别为蓝色和绿色，为A-和p区域。右:整个对称相关区域的三维结构，包括tRNA分子的a位点(蓝色)和p位点(绿色)3 '端的CCA端。上图所示的区域被包围。红点和棒分别表示从顶部和从侧面看的双对称轴的近似位置。
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左上角:描述旋转机构基本原理的示意图。tRNA 3 '末端用香蕉形状的物体表示，用虚线分为组成它们的四个核苷酸。后墙被画成肋骨。前壁锚定核苷酸A2602和U2585没有清晰显示，但它们与tRNA 3 '末端的相互作用用彩色圆圈标记。
右上角:所示为旋转部分(在浅蓝色框内)，即氨基酰化tRNA 3 '端及其与tRNA受体茎的连接，该连接横向易位。
中下:3 '端从A点到p点运动的中间阶段快照的两个垂直视图(从蓝色逐渐到绿色)。核糖体成分显示为灰色，除了两个前壁突起的核苷酸，分别显示为粉红色和洋红色。螺旋运动的模拟是通过旋转tRNA模拟器(ASM，Bashan et al.， 2003)，并在1790年用D50S将其翻译到隧道的方向2Å。
图5 c:
左:上图:碱基A2602在与底物类似物或抗生素的不同50S配合物中的位置。底部:选定的A2602位置，相对于旋转的3 '端显示在两重轴上。A-到P-的过渡由蓝色(A)到绿色(P)的渐变表示，如图5B所示。
正确的:在旋转结束时，亲核胺(A-Site)和游离羰基(P-Site)位于立体化学位置，适合肽基键的形成和底物介导的化学催化(Bashan等，2003；Agmon等人，2005年；Sievers等人，2004年PNAS;Youngmanet al, 2004 Cell;Weinger等人，2004年Nat Struct Mol生物学)
图5 d:
旋转tRNA 3 '端的动态表示。在旋转的每个位置，引导旋转部分的PTC后壁核苷酸闪烁。如图5A所示，A-到P-的通道由蓝色(A)到绿色(P)的渐变表示。
图5 e:
PTC特征(灰色)描绘了A->P部位的旋转运动(蓝色到绿色)。
图5 f:
潜在的碱基对供体(显示为原子，在透明气泡内)在PTC(显示为带状)。
图5 g:
左下角:真细菌中的蛋白质L16(蓝色部分)和其对等物Haloarcula marismortuiH-L10e(浅蓝色)。
左上角:对称区域(显示为条带)，其内部接触(显示为原子)和蛋白质L2，它与p位点附近的两个子区域相互作用。
正确的:对称区和蛋白质L36的不同视图，中间是Zn原子(黄色球)。FIGURE5 h:
对称相关区域连接进出tRNA分子。
大亚基中对称相关区域的位置。蓝色和绿色特征分别代表A区域和p区域。右上方的红色特征为亚基间B2a桥(H69-H71)，连接大亚基的PTC与小亚基的解码位点。左下角是右上方显示的视图的缩放。右下方的图像显示了对称相关区域的扩展(金色和粉色)，以及它们的分配。为了帮助可视化输入和离开tRNA之间可能的连接，还显示了三个停靠的tRNA分子。
C. PTC移动性与抗生素协同作用两个普遍保守的核苷酸A2602和U2585向PTC中心凸起(图5B)，不遵守对称性，是非常灵活的。A2602位于a位点tRNA的A73下面，在整个旋转过程中保持接触距离，并表现出多种构象(图4A)。Sparsomycin，一种有效的通用抗生素药物，靶向A2602 (Bashan等人，Mol Cell, 2003;Hansen et al.， Mol biology 330,1061 - 75,2003;Porse等人，PNAS 96, 9003- 8,1999)，以一种与核糖体功能态相关的方式。通过与未占用的大核糖体亚基结合，sparsomycin堆叠到A2602(图6A)，并在PTC中引起显著的构像改变(图5A)，这应该会影响tRNA在a位点的定位(Bashan et al.， Mol Cell 2003)，因此解释了为什么sparsomycin被认为是a位点抑制剂，尽管它不干扰a位点底物(Goldberg and Mitsugi, Biochem Biophys Res Commun 23,453 -9, 1966;Monro等人，《自然》222,356- 8,1969;Porse等，PNAS 96, 9003- 8,1999)。由于它面向p位点(图6A)，可以增强非生产性trna结合(Monro et al.， Nature 222, 356- 8,1969)。相反，当sparsomycin与p位点底物或底物类似物同时进入大亚基时，它只能引起A2602的轻微构象改变，并且由于p位点被p位点底物占据(图6A)， sparsomycin向A2602的堆叠似乎面向a位点(Hansen et al.， J Mol Biol, 330,1061 - 75,2003)。
类似地，位于A2602下方靠近隧道入口的U2585，在整个a - p位点运动过程中与结合氨基酸的接触距离内(图6B)。在D50S与协同抗生素制剂Synercid(图6B)的复合物中，U2585的碱基发生了重大构象改变(图6B)，其中一部分与PTC结合，另一部分阻断蛋白出口通道(图6B)。Agmon等人，2004年；Harms等人，2004年)．这种最近批准的具有良好协同活性的注射药物是链霉菌素抗菌药物家族的成员，其中每种药物由两种协同成分(SA和SB)组成，能够将微弱的抑菌作用协同转化为致命的杀菌活性(图6B和C)。
在临床相关浓度下获得的D50S-Synercid复合物中，SA成分dalfopristin与PTC结合并诱导显著的构象改变;包括U2585碱基180°的翻转，因此瘫痪了其锚定旋转运动和引导新生蛋白进入出口通道的能力(Agmon等人，2004年)．由于U2585的运动对细胞活力至关重要，维持蛋白质生物合成的进程性的压力很可能会试图恢复U2585的正确定位，通过驱逐或重新定位dalfopristin，这与dalfopristin的低抑菌作用相一致。Synercid的SB成分，quinupristin，是一种大环内酯，可与常见的大环内酯结合袋(奥尔巴赫等人，2004年；Schluenzen等人，2001年；Yonath Bashan和2004年；阿达2005)由于其体积较大，喹戊素在隧道内略有倾斜，因此不能有效地阻塞隧道(Agmon等人，2004年；Harms等人，2004年)，从而合理解释了其抗菌效果低于红霉素的原因。
由于在大核糖体亚基内，两个Synercid成分相互作用，U2585的非生产性翻转定位被稳定，并且dalfopristin的出路被阻塞。因此，Synercid的抗菌活性大大增强。因此，这种协同作用药物的两个成分以两种完全不同的方式起作用。Quinupristin (SB成分)在阻断隧道中起被动作用，而dalfopristin (SA成分)则通过阻碍活性位点U2585上一个重要核苷酸的运动来发挥更动态的作用。可以想象，与静态隧道堵塞相比，这种作用模式消耗了更多的材料，这解释了优化的商业Synercid中7:3 dalfopristin/quinupristin的特殊组成，尽管复合物D50S-Synercid的晶体结构表明这两种成分的化学量结合。
FIGURE6:
sparsomycin与空D50S结合和与p位点tRNA模拟物(青色)结合的H50S之间的区别。D50S和H50S中sparsomycin的位置分别以金色和蓝色表示，A2602的相应构象以洋红色和黄绿色表示。
图6 b：
链球蛋白的协同作用:
协同(左下)与D50S结合。
左上角:dalfopristin (SA)结合诱导U2585构象改变(1800 flip)。
正确的:dalfopristin (SA)和quinupristin (SB)位置的两个正交视图:沿着PTC向下和沿着它，包括隧道。
旋转运动如图所示左上右下（Harms等人。2004）
图6 c:
达福普瑞斯汀和奎宁普瑞斯汀在隧道墙内。所有对象都显示为曲面。
D.核糖体动态元素的更多例子
未结合的D50S亚基与组装的核糖体的比较研究突出了具有功能构象迁移的区域。这些特征是如此的灵活，以至于在特定的条件下，它们可能会变得无序，就像从大核糖体亚单位的结构中观察到的那样Haloarcula marismortui(Ban et al.， Science, 289, 905- 920,2000)。其中最具动态性的特征是L1茎控制E-site tRNA的释放(图7A)。该特征由H76-H78螺旋(超过100个核苷酸)和L1蛋白组成。
连接两个核糖体活性位点的亚基间桥:大亚基的PTC和小亚基的解码区，称为B2a，由大亚基的螺旋H69及其延伸螺旋H70构成。这个桥被发现是一个多任务灵活的特征:
-它连接两个核糖体活性位点，因此可以在它们之间传递信号(图7B和C);
-它提供了正确定位tRNA分子所需的许多远程相互作用(图3)(Bashan et al.， 2003；阿达2003而且2003 b）
-它似乎充当了一个“起重机”，协助a位点tRNA螺旋杆的移位(图4A)，与PTC的“螺旋桨”A2602基座(图4B)协同工作，后者积极参与a位点tRNA 3'端的移位(图5A-D)。在核糖体蛋白中也观察到动力学。它们中的一些经历了显著的构象变化，可能与功能相关。蛋白质CTC和L22的描述如下(分别在C节和D节)。这里我们关注蛋白质S18。我们发现S18、S2的n端构象和S7、S11的c端构象都指向解，在两个独立确定的30S结构中表现出不同的构象(Schluenzen等人，2000年；温伯利等人，自然，407,327 -339)，表明这些蛋白质延伸相当灵活。特别是，只有与起始因子3 (IF3)或其竞争对手(IF3)的c端结构域结合，n端延伸的15个残基才会有序。Pioletti等人，2001年)，由18个钨原子组成(Schluenzen等人，2000年)，这里称为W18(图7D和E)。因此，这些蛋白质延伸似乎起到了触手的作用，增强了IF3等核糖体因子的结合和放置。
图7:
L1柄似乎是负责作为释放e位点tRNA分子的“门”的特征。图中是D50S上部的左侧，如图1所示。在T70S与三个tRNA分子的复合物(绿色)和未结合的D50S(金色)中L1柄的构象所示。红点代表了提议的“打开”(金色)和“关闭”(绿色)大门构象之间的枢轴。还显示了三个停靠的tRNA分子。
图7 b:
未结合的大亚基(红色)和组装的核糖体(金色)中B2a亚基间桥(大亚基23S RNA的H69)构象的叠加。小亚基由Helix H44表示，它提供解码位点，并参与许多亚基间的相互作用。P-和A-位点的tRNAs也显示出来。可以看到，在组装的核糖体中，p位点tRNA占据了H69在未结合的大亚基中使用的部分空间。
图7 c:
建议创建桥B2a (H69)的动态表示。
当起始复合物到达大亚基形成一个组装的核糖体时，p位点RNA占据了H69在未结合的大亚基中使用的位置。因此，它将其推向小亚基，创建连接解码位点和肽基转移酶中心的桥梁。起始复合物由小螺旋H44(白色)和p位点tRNA(洋红色)表示，在解码中心与它结合。大亚基由B2a桥(青色)表示。图7 d:
IF3(c端结构域)与蛋白S18的结合
T30S与W18(其竞争对手)复合物中蛋白S18的构象以及IF3、IF3C (Pioletti等人，2001年)．注意n端结构域构象的相似性。图7 e:
S18 n端扩展中有序/无序的动态表示。
注意W18(红白粉球)如何在无配位结构中观察到的无序n端扩展中引入一个顺序(如温伯利等人，自然，407,327 -339)。CTC:一种核糖体蛋白，可调节tRNA结合
CTC是一种新型的D50S蛋白，在tRNA与D50S结合时发生构象变化，尽管它不直接与D50S相互作用。蛋白质CTC取代大肠杆菌蛋白L25及其蛋白t .酸奶同系物,TL5。之前它包含三个畴(图8)，其中n -端(N-CTC)和中间畴(M-CTC)折叠，拓扑结构接近TL5, N-CTC与的相似大肠杆菌蛋白质L25。在D50S中，N-CTC位于中央突起的溶剂侧，填充了5S和L7/l12臂之间的空间，并包裹了B1a亚基间桥的主要成分H38螺旋的大部分，也称为a位点指。正如在H50S的结构中观察到的那样，这种桥高度灵活，因此很容易变得无序(Ban等人，Science, 289, 905- 920,2000)。在温和的生理条件下，N-CTC似乎可以保护这座桥免受不受控制的运动或相互作用。进一步的保护似乎是由M-CTC包裹这一区域，可能是为了防止滑动或类似的运动，可能发生在生长所需的高温下t .酸奶．类似的温度保护机制在t .酸奶小核糖体亚单位。基因研究表明S17蛋白与热稳定性相关。只有在嗜热细菌中，S17具有长c端尾巴。这条尾巴在一个狭窄的凹槽内卷曲(图9)，该凹槽将身体与平台分开，已知参与协助易位的运动。在这个位置，S17可以作为一个物理塞子，阻止平台在高温下可能发生的不受控制的滑动C-CTC放置在亚基间界面边缘，到达a位点tRNA受体茎的位置。由于它通过一个细长的连接器连接到M-CTC，它可能作为一个a位点结合调节器，这一机制与耐辐射奇球菌的杰出的生存。因此，我们提出了一个可能的连接之间的三个领域的CTC和生活在温和，嗜热和压力条件下。
图8:蛋白质CTC
图8：
放大到大的子单元的界面侧的上部，如图1所示，在主主页的旋转图像中。RNA和蛋白质的主干都是灰色的，除了蛋白质CTC，它是根据上面面板显示的方案着色的。在右侧，突出显示了蛋白质CTC保护的两个功能相关特征的大致位置。H38，也称为B1a亚基间桥或a点指，以青色显示。a位点tRNA的受体茎的位置以粉红色显示。图8 b:
D50S中PTC及其环境的两个近似正交视图，包括衬底模拟物(红色)和停靠的a -和p -位点trna(分别为青色和橄榄绿)。
图8 c:
tRNA结合诱导的构象变化的动态表示。蛋白CTC在原生D50S中的构象为深粉色，与tRNA模拟物的复合物为金色。
图9:
蛋白质肌力S17蛋白在平台和小核糖体亚基下部之间的位置。隧道门控和蜂窝调节
从肽键形成的位置延伸到大核糖体亚基的另一侧，出口隧道提供了新生蛋白质的出现路径。最重要的是，这个通道是许多大环内酯类抗生素的目标，它们结合到一个特定的口袋并阻碍新生蛋白质的进展。
图10:
半透明(灰色)表示大核糖体亚基减半耐辐射奇球菌的(D50S)，经晶体学测定。一个模拟的新链(黄色)标记了隧道的大致位置和形状。蛋白质L4和L22显示，因为它们形成隧道收缩。
底:
翻转尖端的动态表示，在隧道入口观看。
图10 c:
道的化学。左:红霉素和陶的化学成分(见E节和图11)。在红霉素中存在而TAO中不存在的羟基被圈出来。正确的:红霉素(红色)和TAO的位置，垂直于隧道的长轴。
图10 d:
陶结合与延伸阻滞的相关性
上图:50S亚基的整个rRNA，从隧道入口观察(左)，以及从界面端(右)．所示为整个蛋白质L22，其原生结构为青色，反转构象为洋红色。模拟的SecM阻滞序列为金色，TAO为红色，p位点tRNA为绿色。底部象征着我们提议的隧道封锁机制。它显示了TAO(黄色)和隧道(垂直视图)中建模的SecM阻滞序列(蓝色)的叠加，突出显示(红色)核糖体阻滞的关键残基的位置(红色为Trp和Ile)。的左面板显示了D50S/TAO中摇摆构象的电子密度差图。图10 e:
隧道中的TAO
左:TAO(金)在隧道中的位置，与红霉素(红色)和模拟的5残基肽(绿色)相比。正确的:隧道的对角线视图，显示TAO(金色)和翻转的L22发夹尖端的原生(青色)和翻转(洋红色)结构。E.新生链与第一个伴侣的相遇:触发因素
尽管在原则上，蛋白质可以在没有其他因素的帮助下折叠，因为它们的序列包含了它们独特的折叠，但在细胞条件下，从核糖体隧道中出现的新生多肽易于聚集和降解，因此需要帮助。促进正确折叠和防止错误折叠的细胞策略涉及大量的分子伴侣。
触发因子(TF)是真细菌的一个独特特征，是遇到新生链的第一个伴侣。该48 kDa模块化蛋白由三个结构域组成，其中TF n端结构域(TFa)含有保守的“signature motif”，介导与核糖体的关联。它与DnaK系统合作，它们的共同消耗导致新合成多肽的大量聚集以及30°C以上的细胞死亡(Deuerling等人，Nature 400,693 - 6,1999)。
D50S与来自同一来源的TFa复合物的高分辨率晶体结构表明，TFa结合(图11A和B)在核糖体蛋白L23和L29与23S rRNA (巴拉姆等人，2005年)，表明TFa结合后发生了显著的构象重排(图11C)。这些改变导致核糖体出口隧道内部暴露出一个相当大的疏水斑块，这应该会增加隧道对正在出现的新生多肽疏水片段的亲和力。因此，触发因子通过提供相互竞争的疏水环境(巴拉姆等人，2005年)．
在真细菌中，蛋白质L23具有一个独特的特征，即位于核糖体隧道壁上的一个细长的疏水环(图11A和B)。该环可能可用于与进展中的新生链相互作用;因此它可以参与共平动折叠。因此，L23蛋白似乎在真细菌中起着多重作用。它对于TF与核糖体的结合至关重要，并可能控制新生链进入其庇护所的速度，因此在隧道中作为细胞与新生链通信的通道。
图11:
大核糖体亚基的侧视图。rRNA和r-蛋白(除L23和L29外)分别以棕色和暗红色条带显示。结合的触发因子结合域(TFa)以橙色显示，核糖体蛋白L29和L23分别以品红和蓝色显示，建模的多肽链以绿色显示。注意L23的细长环，这是一种独特的真菌特征，它到达隧道的内部，到达一个允许它与正在出现的新生链相互作用的位置。
图11 b:
大核糖体亚基隧道开口的“表面表示”。rRNA和r-蛋白(除L23和L29外)分别以棕色和暗红色条带显示。结合的触发因子结合域(TFa)以橙色显示，核糖体蛋白L29和L23分别以品红和蓝色显示，建模的多肽链以绿色显示。注意L23的细长环，这是一种独特的真菌特征，它到达隧道的内部，到达一个允许它与正在出现的新生链相互作用的位置。
图11 c:
触发因子与大核糖体亚基结合后构象改变。
前:处于绑定和未绑定状态的触发因子绑定域(TFa)。右图显示了结合后暴露的疏水区域。
底: TFa结合基序(称为L1环)在同源(耐辐射奇球菌的)和嵌合(50S来自Haloarcula marismortui与TFa大肠杆菌)复合物。右边图像显示了同源复合物中的整个TFa结构域与嵌合复合物中可以分解的区域进行比较(Ferbitz等，Nature 431, 590-6)。
F.抗生素靶向核糖体
对抗生素的耐药性是现代治疗中的一个主要问题。抗生素是天然或人造的化合物，旨在干扰新陈代谢或微生物，并通过抑制基本的细胞过程来消灭它们。致病菌的核糖体为许多抗生素提供了靶点。来自真细菌的两个可结晶核糖体亚基T30S和D50S被发现适合作为病原体模型(Pioletti等人，2001年；Schluenzen等人，2001年；2003；Bashan et al.， 2003；Berisio等人，2003a；Berisio 2003 b；Schluenzen等人，2004年；Harms et al.， 2004; 奥尔巴赫等人，2004年；Yonath和Bashan 2004; 阿达2005)通过分析这些核糖体颗粒与抗生素复合物的高分辨率结构，揭示了抗生素的选择性，并阐明了它们的各种作用模式，从降低解码精度，通过限制构象迁移率，到干扰底物结合和阻碍蛋白质生长的进程。我们发现抗生素主要与核糖体RNA结合，在许多情况下，它们不会引起主要的构象变化。只有少数几种药物能引起显著的变构改变，其中包括sparsomycin。这种通用抑制剂在A-和p -位点引发了显著的构象改变，因为它与A2602形成了堆叠相互作用，显示为一种高度可移动的核苷酸(图3,4B和7D)。a.小亚单位抗生素
已知氨基糖苷类会使翻译仪器高度不准确。它们与解码位点相邻并影响其方向。四环素被发现是一种多位点抗生素，其抑制作用源于其对a位点tRNA结合的干扰。一致地，该结合位点也与获得四环素耐药性的16S RNA突变非常接近。Edeine是一种通用药物，通过连接tRNA, IF3和mRNA运动的关键特征来抑制蛋白质合成的启动。它还在平台的主要螺旋之间诱导了变构碱基对，从而限制了其构象迁移，影响了p位点tRNA的定位，并阻碍了IF3的调节作用。因此，edeine表现出一种新颖的作用模式。它通过与核糖体结合来防止采用核糖体功能所需的构象，并诱导变构变化，形成相当遥远的新碱基对，这是抗生素作用的重要原理(图12)。
图12:
Edeine是一种通用的小亚单位抗生素图12:
edeine的结合位点，通用抗生素剂，通过将核糖体平台，16S RNA的H23和H24的关键特征连接在一起，抑制蛋白质合成的起始。这些成分的移动性是mRNA/tRNA转位所必需的。小亚基显示为不透明的灰色体，mRNA通道位于“颈部”的中间，从图1和主主页上旋转图像的对角线来看。edeine的化学结构也显示在上面。结合的edeine(蓝色)引起变构构象变化，在螺旋H23和H24之间形成一个新的碱基对(绿色)。该新碱基对的电子密度图如图所示。
edeine结合的动态表现及其产生的变构重排-新的碱基对。
颜色代码如图12A所示b。大亚单位抗生素:
1。大环内酯，酮内酯和PTC抗生素大多数临床有用的抗生素靶向PTC、其附近或核糖体隧道入口的大亚基(图13A-C)。从结构上讲，针对PTC的抗生素可以分为两类。第一组的成员阻断底物结合或干扰肽键的形成。第二组的成员阻碍PTC或衬底运动。氯霉素、克林霉素、蒂阿木林、sparsomycin和链霉素都以PTC为靶点(图13B) (Bashan et al.， 2003；Harms等人，2004年)，尽管空间有限，而且它们结合的结果明显相似，但每种化合物的作用方式不同。氯霉素只阻断A位点，而克林霉素、蒂阿木林和链霉素则同时与A和P位点结合。此外，在它们的结合和PTC构象之间的相互作用中观察到显著的差异。氯霉素和克林霉素几乎不引起任何构象改变，而蒂木林引起细微变化，而斯潘霉素(Schluenzen等人，2004年)和链(Harms等人，2004年)通过触发实质性的改变而行动。
酮内酯属于大环内酯家族的高级类，旨在克服大环内酯耐药，由A2058甲基化或其突变为G。它们的特征是在大内酯环的第3位上有一个酮基，一个单一的氨基糖基团和一个延伸的疏水臂。作为大环内酯，酮内酯结合到真细菌隧道中的特定口袋，并通过产生核糖体出口隧道的空间阻塞和阻碍新生链的进展而起作用。与大环内酯不同，大环内酯主要结合在隧道的一侧，酮内酯的延伸臂到达隧道的另一侧(图13C)。通过这种方式，它们弥补了A2058 (Schluenzen等人，2003年；Berisio等，2003)．
的大环内酯类在美国，含有12-16个内酯环的抗生素可以阻止现有的新生链的发展。核苷酸A2058是结合和选择性一致性的关键决定因素，14个大环内酯抗性是通过A2508的A->G突变或其甲基化作用获得的。15和16元大环内酯的选择性较差。(图13)。然而，它们的结合需要极高浓度的抗生素。重要的是，大环内酯在2058位置上与含有鸟嘌呤的大亚基结合，其定向构象对新生链进展的阻断效果较差(图14B)。
图13:
以红霉素(红色)为代表的隧道阻滞剂与以氯霉素(蓝色)为代表的a位点PTC(绿色)通过克林霉素(绿色)重叠，克林霉素在a和p位点之间结合并延伸到隧道内。图13 b:
PTC抗生素
氯霉素(CAM)、克林霉素(CLI)、提亚木林(TIA)和链脲(SynA)的结合模式。核糖体成分为灰色，A-和p位点tRNAs分别为蓝色和绿色)。
2.突变使大环内酯结合:
大环内酯的晶体结构结合到大核糖体亚基耐辐射球菌， d50 (Schluenzen et, 2001)，是一种类似病原体的真细菌，即太古菌Haloarculla marismortui与真核生物具有相同特性的H50S (Hansen et al, 2002 Mol Cell)及其允许大环内酯结合的单碱基突变体G2058A (Tu et al, 2005 Cell)(称为MH50S)表明，尽管核糖体总体上是保守的，但微妙的变异主导了抗生素的选择性，从而促进了它们的治疗用途。它还显示了结合和抗生素有效性之间的差异。
G2058在h . marismortui23S rRNA最近突变为腺苷(Tu et al.， Cell 121, 257-270, 2005)。这种突变(称为below mH50S)将大环内酯的结合亲和力提高了10000倍，但并没有显著提高结合模式的有效性，因为mH50S中的隧道堵塞程度仍然低于同一药物在真菌D50S中的效果(图14B)。这一发现表明，尽管2058同一性决定了是否发生结合，但大环内酯口袋中其他核苷酸的构象和化学同一性决定了抗生素的结合模式，进而决定了药物的有效性。
有趣的是，所有mH50S结合的大环内酯/酮内酯都具有相似的构象，这几乎与核磁共振研究表明的在无核糖体环境中自由能最低的构象相同。这些无核糖体实验忽略了核糖体，核糖体通过提供一个重要的相互作用网络，从根本上改变了药物环境。因此，药物在隔离状态下构象的保存与核糖体与大环内酯/酮内酯之间的高结合亲和力不一致。
特利霉素-mH50S复合物的情况(图14B)显示了结合和有效性之间的分离，因为在mH50S中，特利霉素不会产生酮内酯与结构域II的显著相互作用(图14)。同样，特利霉素和红霉素结合模式之间的相似性与A2058G核糖体对酮内酯的敏感性之间的深刻差异不一致(Pfister等人，2005年)．
大环内酯/酮内酯与mH50S结合模式的奇怪性质背后的原因可能与高盐度(> 2.5 M KCl)有关h . marismortui最优生长和保持其完整性(Shevack et al.， 1985;特,2002)。可以想象，除了古菌和真菌之间的系统发育和构象变化外，这导致了D50S和H50S-mH50S中抗生素构象的不同(巴拉姆和约纳特，2005；Pfister等人，2005年)， H50S和mH50S内的高盐度掩盖了可能与药物相互作用的潜在核糖体实体。
综上所述，2058年G -> A突变h . marismortui核糖体被发现是最有益的核糖体抗生素研究。它证实2058是大环内酯结合的关键参与者;明确了单纯结合与抗生素抑制作用的区别;它为一个有趣的问题提供了结构性的见解，这个问题对药物开发也是至关重要的:在无核糖体环境中确定的“最低自由能构象”与抗生素的结合及其治疗效果有什么相关性?换句话说:在无核糖体环境中确定的药物的“最小自由能构象”与其治疗效果之间是否存在相关性?
图14:
几个大环内酯、一个杜鹃花和一个酮内酯在垂直于蛋白质出口通道长轴的截面内的位置。隧道壁显示为半填充空间，与相关核苷酸的位置。A2508是大环内酯选择性和抗性的关键因素，用粉红色突出显示。
左下:红霉素(红色)和2058，在D50S/红霉素复合物中观察到。
右下角:鸟嘌呤(绿色)取代了腺嘌呤2058。
图14 b:
大环内酯类化合物的选择性和结合(以H50S, mH50S和D50S为靶标)
大环内酯结合袋在真菌核糖体(50S，蓝色)和太古菌H50S(绿色)的叠加。请注意系统发育和构象的差异，这导致在H50S中有效结合较差(即在所有情况下，隧道的一小部分被阻塞)。
另外请注意(左下)，与原生H50S和G2058A突变体的结合模式几乎没有任何差异，尽管与后者的结合亲和力比与原生嗜盐核糖体的结合亲和力高106。
特别令人感兴趣的是特利霉素，这是一种在真细菌(包括所有病原体)中可以到达II结构域的酮内酯，它只在太古菌H50S中结合(以折叠状态)到V结构域。
下一代环保抗生素
抗生素耐药性是当代医学中的一个严重问题。在确定了靶向细菌核糖体的抗生素作用模式的共同特征后，这些抗生素阐明了上述抗生素抑制作用的共同途径(即与核糖体功能位点结合)，为了阐明传染病易感性的物种特异性多样性，我们确定了多重耐药致病菌的核糖体结构。仔细比较致病性细菌和非致病性细菌的结构发现了新的结构基序，这些结构基序对蛋白质生物合成至关重要，但并不位于主要核糖体活性位点，因此目前还不知道它们的修饰机制可能导致耐药性。因此，预计耐药性出现的速度较慢，效率较低。这些发现促使人们设计出具有理想成分的抗生素，这些成分可以在化学性质、毒性、细胞穿透性和物种特异性方面进行优化，从而保护微生物组(当前抗生素无意中破坏了微生物组)，并提高其生物降解性，从而减少当前抗生素代谢产物中不可消化成分造成的生态危害。Matzov et al 2017a，Auerbach-Nevo等人2016
图15:
的色带表示金黄色葡萄球菌(SA)大核糖体亚单位(SA50S)，灰色。图中显示了一些用青色标注的目标位点。洋红色的弧线表明了一个潜在的下一代抗生素结合位点。
应答:
如果没有EMBL和DESY的MPG同步辐射设施、EMBL/ESRF的ID14和ID19/APS/ANL的同步辐射设施工作人员的合作、协助和建议，这些研究就无法进行。马克斯-普朗克学会、美国国立卫生研究院(GM34360)、德国科技部(赠款05-641EA)和魏茨曼研究所的Kimmelman大分子组装中心提供了支持。
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