方法

基于酵母

回答上面提出的一些问题。我们目前正在使用基于酵母的筛选来识别通道孔开口之前的门控特异性,否则传统的生化或结构功能方法无法检测到这些特异性。我们还使用各种分子技术来了解单分子水平上的通道功能,主要是使用膜片钳单通道记录。


图3:单通道记录KcsA(左)结构模型中突变体的痕迹(右)。

构象动力学和通道门控和分子内蛋白质重排的信号特异性正在使用荧光共振能量转移(FRET)结合先进的显微镜技术进行研究。这些研究还包括G蛋白调节神经元钙通道和线粒体离子稳态的研究。

荧光

我们目前正在开发小鼠系,以研究唐氏综合征的神经表现、通道在免疫系统中的参与以及使用荧光技术的正常离子通道功能可塑性(图4)。通道的代谢调节和亚细胞定位正在两个层面上进行研究。一种是使用常规的生化和电生理方法,另一种是通过大量生产通道结构域进行结构和蛋白质组学研究。最后,一种更通用的基于荧光的方法正在开发中,用于检测活细胞中G蛋白相关信号,用于生成用于GPCR活性的纳米传感器和用于孤儿GPCRs药物发现方法。


图4:在wt和敲入小鼠的大脑中,GIRK1基因被与黄色荧光蛋白(YFP)融合的wt基因取代。左图,荧光图像(只有敲入鼠标的大脑是荧光的——右脑)。右面,同样的大脑在正常照明下从底部看。