近年来，ISPC采用了两种基于载体和插入物全质粒扩增的连接独立克隆(LIC)策略:
- 无限制(RF)克隆
- Transfer-PCR (TPCR)
射频(van den Ent和Lowe，Unger等人。，法勒和昂格)及TPCR (Erijman等.，Erijman, Shifman和法勒)程序是通用的克隆方法，允许将DNA片段精确插入圆形质粒的任何所需位置。这两种方法都基于包含侧翼目标载体特异性序列的大型引物的合成(最多几kbs)。在线性放大反应中，超级引物在预先设计的位置集成到目标载体中。
射频克隆分为两个阶段:
- 大型引物的合成和纯化。
- 将大型引物整合到目的载体中，生成包含感兴趣基因的新的重组载体。
TPCR是一种单管克隆反应，所有的反应成分都混合在一个管中。反应效率高度依赖于初始引物浓度(每个引物10-20 nM)。
RF/TPCR方法成功地应用于各种应用，以操纵目标DNA序列。下图演示了一些这样的应用程序。
RF/TPCR应用示意图
RF和TPCR的优点
- 任何选择的向量都可以使用
- 载体和PCR产物均不需要酶切
- 克隆可以在任何想要的位置进行
- 不需要对受体载体(圆形载体)进行任何预处理
- 不需要购买任何商业套件
- 廉价快速-只需要耐热聚合酶(例如，Phusion, NEB的Q5)