出版物
2022
利用扫描透射电子显微镜和反褶积处理技术对细胞核进行了冷冻电子断层扫描,突出了大规模的100- 300nm间期染色体结构,该结构存在于整个细胞核中。本研究进一步记录和分析了这些染色体结构。本文共分为四个部分:1)间期染色体结构统一的证据(初步);2)提出了统一的间期染色体结构;3)组织为染色体区域(例如,将46条人类染色体装入直径为10 μm的细胞核中);4)结构统一为多线染色体结构和灯刷染色体。最后,本文以活光镜细胞研究结束,显示G1细胞核自始至终包含非常相似的结构。主要的发现是,这种染色体结构似乎将11纳米核小体纤维盘绕成一个明确的中空结构,类似于Slinky螺旋弹簧[https://en.wikipedia.org/wiki/Slinky;motif用于Bowerman等人,eLife 10, e65587(2021)]。这种Slinky结构可用于构建染色体区域,扩展到多线染色体结构,以及灯刷染色体结构。
提出了一个具有代表性的有丝分裂染色体,人染色体10的分子结构。这种结构建立在基于低温电子显微镜(cryo-EM)细胞断层扫描的间期染色体结构上[J]。Sedat等人,Proc. Natl。学会科学。因此在整个有丝分裂周期中统一染色体结构。有丝分裂染色体的基本组织原理是将11纳米核小体纤维特定地盘绕成大规模的~ 200纳米间相结构,即Slinky [https://en.wikipedia.org/wiki/Slinky;motif引用于S. Bowerman等人,eLife 10, e65587(2021)],然后进一步修改后续额外的线圈,以获得最终的有丝分裂染色体结构。最终的有丝分裂染色体结构说明了尺寸值以及众所周知的细胞学配置。此外,数字PCR技术实验证明G1 T细胞核为二倍体,每条染色体有一个DNA分子。许多核小体连接子DNA序列,启动子和增强子,提示在大规模线圈表面的最佳暴露。
疟疾是一种潜在的致命传染病,由专性细胞内寄生虫恶性疟原虫引起。寄生虫感染人类红细胞(RBC),通过血红蛋白的分解代谢获得营养。当氨基酸从蛋白质成分中被吸收时,有毒的血红素被释放出来。分子血红素通过在寄生虫的消化液泡(DV)内快速隔离到生理上不溶的疟原虫色素晶体而解毒。常见的抗疟药物会干扰这种结晶过程,使寄生虫容易受到自身代谢副产物的影响。一个对药物机制具有重要意义的基本争论是关于原位结晶的化学环境,无论是水结晶还是脂结晶。这个问题之前已经通过低温软x射线断层扫描得到解决。我们采用低温扫描透射电子断层扫描(CSTET)以更高分辨率在完全水化、玻璃化状态下探测寄生虫细胞的整个生命周期。在CSTET数据采集过程中,来自疟原虫色素的布拉格衍射以纳米分辨率提供了晶体边界的独特清晰视图。没有中间介质,如脂质涂层或包裹,可以检测到周围的晶体。 The present study describes a unique application of CSTET in the study of malaria. The findings can be extended to evaluate new drug candidates affecting hemozoin crystal growth.
2021
低温电子断层扫描(cryo-ET)允许生物大分子的高分辨率可视化。然而,该技术受到低信噪比(SNR)和不同频率对比度方差的限制,以及Z分辨率的降低。在这里,我们将熵正则化反褶积(ER-DC)应用于透射电子显微镜(TEM)生成的冷冻et数据,并使用加权反投影(WBP)重建。我们对几个原位冷冻et数据集进行反褶积处理,并通过傅里叶分析和亚层析图分析(STA)评估结果。
扫描透射电子显微镜(STEM)的最新进展重新点燃了人们对多通道探测器的兴趣,并促进了对非常规扫描模式的探索。这些新出现的需求还没有被标准的商业硬件所满足。这里描述的系统包含一个灵活的扫描生成器,可以探索低加速扫描模式,同时数据由一个可伸缩的八通道非多路模数转换器阵列记录。与SerialEM的系统集成为自动采集协议(包括断层扫描)提供了灵活的路径。使用带有附加环形环的固态象限探测器,我们探索了各种STEM对比模式的生成和检测。透焦亮场扫描与相位对比有关,与宽场透射电镜类似。更引人注目的是,比较从不同离轴探测器元素获得的图像,揭示了依赖于离焦的横向移位。这种视差效应的补偿导致集成差分相位对比度(iDPC)分解为与投影电势和散焦有关的可分离贡献。因此,一次扫描提供了计算重新聚焦的相位对比图像和第二图像,其中有符号的强度,亮或暗,代表离焦程度。
电子显微镜(EM)是研究物质的最通用的工具,范围从亚原子到可见。高真空环境和带电辐照需要小心地稳定许多感兴趣的样品。生物样品由于其轻元素的组成悬浮在水介质中而特别敏感。早期研究人员开发了用重金属盐嵌入和染色的技术来增强对比。的确,1974年的诺贝尔奖承认克劳德、德杜夫和帕拉德建立了细胞生物学领域,这主要归功于他们在电子显微镜分离和保存细胞成分方面的发展。十年后,低温固定被引入。水的玻璃化避免了脱水的需要,并提供了有机大分子悬浮的理想基质;该标本代表了一种原生状态,在低于- 150°C的温度下突然冻结。低温维持了电子显微镜的低蒸汽压,介质的非晶态性质避免了晶体冰的衍射对比。然而,这样的样本是极其微妙的,而低温电磁成像是一场信息竞赛,面对持续不断的电子照射损伤。 Through this journey, cryo-EM enhanced the resolution scale from membranes to molecules and most recently to atoms. Cryo-EM pioneers, Dubochet, Frank, and Henderson, were awarded the Nobel Prize in 2017 for high resolution structure determination of biological macromolecules.
疟原虫色素晶体的生物成因形成,是疟疾寄生虫血红素解毒的一个关键代谢过程,被认为是一种抗疟药物靶点。从疟疾色素(疟原虫色素的原始术语)的历史描述开始,本视角首先关注疟原虫色素在体内的形成。基于X射线和电子显微镜所获得的原生对比三维成像,提出了一个模型,疟原虫色素在消化液泡的内膜小叶成核,在邻近的水介质中生长。我们介绍了在消化液泡中发现的疟原虫色素的数量和我们的模型,其中血红素从血红蛋白中释放和疟原虫色素的形成是一个装配线过程。在结晶之前,血红素单体之间发生反应,产生血红素二聚体,构成血色素。生物疟原虫色素比合成疟原虫色素包含更少类型的二聚体血红素异构体,这表明蛋白质‐激活血红素二聚体。这种流水线工艺对抑制疟原虫色素形成的药物类型有影响。本文综述了抗疟药物及其在疟原虫色素表面吸附的模型。最后,我们观察到溴喹,一种氯喹药物类似物,在疟原虫感染的红细胞内覆盖了大量的疟原虫色素晶体表面,并在消化液泡膜上积聚药物,推测为溴喹-血红素二聚体复合物。
我们发现不同APbBr3单晶(A = CH3NH3+,甲基铵(MA);HC(NH2)2+,甲酰胺(FA);铯,Cs+)。利用1-光子显微镜和2-光子显微镜和光漂白技术,我们得出了动力学主导表面和热力学主导体稳定性的结论。荧光寿命成像显微镜以及其他几种方法的结果将卤化物钙钛矿(HaP)在光漂白后的(损坏)状态与其修改的光学和电子性能联系起来。A阳离子类型对恢复和降解的动力学和热力学均有强烈影响:FA对大块材料的愈合效果最好,自愈合速度更快;Cs+保护表面最好,是A阳离子中挥发性最小的,可能通过o钝化;MA通过光解离的甲胺钝化缺陷,与Pb2+结合。DFT模拟提供了MA的钝化作用,也表明了Br3−缺陷的重要性,并预测了其稳定性。自愈合的发生和速率可以解释HaPs的低有效缺陷密度,并由此解释其优异的性能。 These results rationalize the use of mixed A-cation materials for optimizing both solar cell stability and overall performance of HaP-based devices, and provide a basis for designing new HaP variants.
基于蛋白质变性率受熵相关势垒限制的模型,我们推导出病毒失活时间随温度变化的简单公式。蛋白质结构的损失由两个反应坐标来描述:聚合物构象紊乱和溶剂润湿。这些建立了构象熵和疏水相互作用之间的竞争,分别倾向于随机线圈态或球状态。基于朗道相变理论,发现所产生的自由能势垒随温差T - Tm线性减小,失活率应随U的T - Tm次方而增大。这种形式回忆了热疗中对细胞的热损伤的一个公认模型。对于SARS-CoV-2,以摄氏度为单位的U值为1.32。虽然模型对实测数据的拟合与具有活化能的阿伦尼乌斯定律几乎没有区别,但熵垒机制更适合,可以解释SARS-CoV-2对热损伤的显著敏感性。因此,我们预测轻度发热在一段~ 24小时内对灭活病毒的效力。
2020
生物细胞和组织的复杂环境推动了光学和电子显微镜三维成像的发展。为此,荧光显微镜的主要工具之一是计算反褶积。宽视场荧光图像常因光失焦而产生雾霾,即三维图像中不同物面之间的串扰。利用对图像形成机制的先验理解,可以抑制串扰,并将未聚焦的光重新分配到其适当的事后源。由于离散的角度采样和有限的倾斜范围,基于倾斜投影的电子断层扫描也表现出遥远平面之间的串扰。通过使用适当合成的3D点扩散函数,我们在这里表明反褶积导致了从冷冻扫描透射电子断层扫描(CSTET)重建的体积数据的类似改进,即显著的平面内噪声降低和轴向维度特征的改进表示。首先用胶体金颗粒进行对比增强,然后在完整细胞的代表性冷冻成像中进行对比增强。从完整核周围收集的CSTET数据的反褶积显示间期染色质部分浓缩,延伸结构。
2019
农杆菌介导的植物转化是一种被充分研究的现象,其中细菌DNA片段(T-DNA)通过IV型分泌系统作为单链转移到寄主植物细胞,并有可能到达细胞核并整合到其基因组中。虽然农杆菌介导的转化已广泛用于实验室研究和育种,但其从细菌到细胞核的过程,从单链到双链中间体的转换以及基因组整合的几个方面仍然不清楚。在这项研究中,我们试图直接使用单分子活体成像来跟踪T-DNA感染。为此,我们将LacO-LacI成像系统应用于benthamiana烟草,使我们能够识别双链T-DNA (dsT-DNA)分子作为荧光焦点。使用共聚焦显微镜,我们检测到在转染后23小时开始,在感染后48和72小时,平均每个细胞核中分别有5.4和8个dsT-DNA焦点逐渐积聚。T-DNA焦点的时间过程扩散分析已经证明了它们的空间限制。
在稀释溶液中取样的蛋白质构象是否与在细胞环境中相同,这是一个悬而未决的问题。在这里,我们通过Gd(III)自旋标签的双电子-电子共振(DEER)距离测量来解决这个问题,以探测钙调素(CaM)在体外、细胞提取物和人HeLa细胞中的构象。利用马来酰亚胺- dota - gd (III)标记的N端和c端CaM突变体N53C/T110C和T34C/T117C,我们观察到广泛而不同的域间距离分布。在IQ靶肽存在和不存在的情况下,apo-CaM和holo-CaM的体外距离分布可以用闭合、开放和折叠构象的组合来描述。在细胞提取物中,apo-和holo-CaM与靶蛋白的结合方式与体外apo-和holo-CaM与IQ肽的结合方式相似。然而,在HeLa细胞中,无论是否存在细胞内Ca2+水平升高,CaM意外地产生了更开放的构象和非常宽的距离分布,表明与细胞内成分有许多不同的相互作用。这些结果表明了细胞内蛋白质结构分析的重要性。
使用扫描传输方式(STEM)的电子冷冻断层扫描可以对厚达1 μm或更厚的未染色的玻璃化标本进行3D重建。对比与质量/厚度和原子序数有关,提供完整的原核和真核细胞的可量化的化学表征和质量映射。通过STEM的能量色散x射线光谱提供了一个简单的,在亚细胞有机物或矿床的元素组成的现场化学鉴定。本章提供了在玻璃化生物细胞上进行冷冻stem断层扫描的基本背景和实用信息。
2018
电子断层扫描技术提供了生物细胞和组织的三维结构的详细视图。通过玻璃化的水介质物理固定提供了最忠实的保存生物标本在原生,充分水化状态。然而,由于对电子照射的敏感性和有机材料的弱电子散射,冷冻显微镜是具有挑战性的。断层扫描更具挑战性,因为它依赖于同一区域的多次曝光。层析成像通常在宽视场透射电子显微镜(TEM)模式下进行,由离焦产生相位对比。扫描透射电子显微镜(STEM)是一种基于聚焦探针束散射检测的替代模式,没有成像光学跟随样本。虽然需要仔细配置照明和探测器来产生有用的对比,但STEM绕过了相位对比TEM对非常薄的样品的主要限制,并提供了更简单地根据局部成分和密度解释的信号。近年来,STEM在材料科学领域越来越受欢迎。本文综述了STEM技术在细胞和大分子的冷冻显微镜和断层扫描中的应用。
恶性疟原虫是最致命的人类疟疾的病原体,其可变抗原的表达由一个名为var的多拷贝基因家族的成员编码。在var2csa(涉及妊娠相关疟疾的var基因)中,翻译抑制由仅在其5' UTR中发现的独特上游开放阅读框(uORF)调控。在这里,我们报道了这种翻译的uORF显著地改变了转录和翻译后的蛋白质运输。寄生虫可以改变蛋白质的目的地,而不需要对蛋白质本身进行任何修改,而是通过转录本5' UTR中的一个元素来改变。单分子STORM成像证实了这种uORF依赖的定位,随后uORF与报告基因融合,将其细胞定位从细胞质改变为er相关。这些数据指向uORF在蛋白质运输中的一种新的调节作用,对妊娠相关疟疾的病理具有重要意义。
细胞和组织的三维超微结构通过断层扫描显示出来。一方面,以尽可能高的分辨率表示分子细节,另一方面,在大体积内可视化大型细胞器甚至相邻细胞之间的空间关系,这两者之间存在固有的紧张关系。低温层析成像技术在保存原始样品方面具有优势,但也带来了特殊的限制。一个主要的挑战是限制比典型细胞更薄的标本。现在有新的成像方式可以将冷冻断层扫描扩展到更厚的标本:冷冻扫描透射电子断层扫描(CSTET),软x射线断层扫描(SXT),以及使用聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)的串行表面成像。每一种都有特定的优点,因此最佳选择取决于分辨率、成分和体积之间的优先级。
Peskett等人(2018)在本期《分子细胞》杂志中,使用荧光显微镜和电子断层扫描相结合的方法,探索了与疾病相关的polyQ扩展的亨廷顿蛋白外显子1的液体状冷凝物中淀粉样丝状物的成核。Peskett等人(2018)在本期《分子细胞》杂志中,使用荧光显微镜和电子断层扫描相结合的方法,探索了与疾病相关的polyQ扩展的亨廷顿蛋白外显子1的液体状冷凝物中淀粉样丝状物的成核。
肠道沙门氏菌在与上皮细胞相互作用时诱导膜皱折和大粒小体的形成。这是通过三型分泌系统-1实现的,它首先介导细菌附着在宿主细胞上,然后注入细菌效应蛋白来改变宿主行为。接下来,沙门氏菌进入目标细胞的早期膜结合室成熟为一个缓慢生长,复制的生态位称为含沙门氏菌液泡(SCV)。另外,病原体破坏早期隔室的膜,并在细胞质中快速复制。在本研究中,我们发现原位形成的大粒小体是沙门氏菌成熟胞内生态位形成的关键因素,而大粒小体之前被认为与沙门氏菌进入的步骤有关。我们首先通过结合经典荧光显微镜和前沿大体积电子显微镜,阐明了三型分泌系统-1诱导沙门氏菌进入上皮细胞的主要模式。我们观察到沙门氏菌,类似志贺氏菌,进入上皮细胞在紧密的液泡内,而不是在大的大颗粒体。接下来,我们应用这项技术来可视化破裂的含有沙门氏菌的隔间,我们使用扩展延时显微镜来建立早期标记,确定哪些沙门氏菌最终会过度复制。我们发现,在感染后期,携带复制沙门氏菌的scv先前已与原位形成的大粒小体融合。相比之下,这种融合事件在超复制沙门氏菌中没有观察到,这表明沙门氏菌入口室与大粒小体的融合是SCV形成的第一步。
自我修复,即某些参数的修改在没有任何外部干预的情况下随时间逆转,是卤化物钙钛矿特别有趣的特性之一。虽然有许多研究表明钙钛矿中的这种自我修复,但它们都是在薄膜上进行的,其中钙钛矿与另一相(包括环境)之间的界面通常是该过程中的主导和干扰因素。在这里,报道了钙钛矿(甲基铵,formamidinium,和铯溴化铅(MAPbBr3, FAPbBr3,和CsPbBr3))单晶体中的自愈合,使用双光子显微镜在晶体内部≈110µm处产生损伤(光漂白),并监测损伤后光致发光的恢复。三种钙钛矿都能自我修复,其中FAPbBr3恢复最快(≈1小时),CsPbBr3恢复最慢(数十小时)。这种行为,不同于表面主导的稳定性趋势,是典型的大块,强烈依赖于降解产物的定位,离损伤部位不远。讨论了自愈机理,并分析了聚溴化物可能参与自愈的可能性。它提供了一个封闭的化学循环,并不一定涉及经常被用来解释卤化物钙钛矿可逆现象的缺陷或离子迁移现象。
STEM模式为较厚(>300 nm)生物标本的电子断层扫描提供了主要优势,无论是塑料嵌入的重金属染色样品,还是玻璃化的未染色细胞。随着现代TEM显微镜的普及,可以相对轻松地在TEM和STEM模式之间切换,我们预计STEM断层扫描的使用将会增加。STEM成像的概念与TEM有显著不同,因此我们将详细描述STEM成像模式,然后是STEM断层扫描的概念和应用。
2017
钙进入线粒体是代谢、细胞器间通讯和细胞生死决定的中心。长期寻找的转运蛋白参与线粒体钙流入和流出最近已被确定。为了获得线粒体钙利用的统一图景,需要在理解线粒体钙储存的形式和数量方面取得平行进展。我们在这里展示了使用冷冻扫描透射电子断层扫描(CSTET)在完整哺乳动物细胞中线粒体钙的直接3D可视化。含有钙和磷的无定形固体颗粒普遍存在于多种哺乳动物细胞类型的线粒体基质中。基于定量电子散射的分析表明,这些储存库相当于溶解离子的摩尔浓度。这些结果最终证明了活细胞线粒体基质中的钙缓冲是通过相分离发生的,并且固相存储提供了一个主要的离子库,可以用于生物能学和信号传递。
金属离子在生物化学的许多方面发挥着重要作用。检测它们在蛋白质和细胞中的存在和位置对于了解生物功能非常重要。传统的结构方法,如x射线晶体学和冷冻透射电镜,只有在蛋白质结构求解到原子分辨率时才能识别蛋白质上的金属原子。我们在这里演示了在铁蛋白上检测孤立的锌和铁原子,使用低温环形暗场扫描透射电子显微镜(cro - stem)耦合单粒子三维重建。锌原子被发现的模式与它们在早先由x射线晶体学确定的氧化铁酶位点上的位置精确匹配。相比之下,铁分布沿着一条弧线涂抹,这条弧线对应于从氧化铁酶位点到矿物成核位点的双轴路径。在这种情况下,单粒子重建被解释为基于单个位置平均值的概率分布函数。这些结果为在电子冷冻显微镜和断层扫描更广泛的背景下检测孤立的金属原子奠定了条件。
VirE2是农杆菌毒力所必需的ssDNA结合蛋白。以resh试剂为基础制备了四胱氨酸突变体(VirE2-TC),用于体内外荧光成像。研究发现,VirE2-TC具有生物化学活性,因为它可以结合ssDNA和酸性分泌伴侣VirE1。它还在拟南芥根和烟草叶转化中补充virE2缺失株的生物学功能。体外实验证明了使用VirE2-TC/ resh和Alexa Fluor 488标记ssDNA的双色荧光复合物。在体内,在与转化相关的时间框架内,在细菌和植物细胞中检测到荧光病毒2- tc /ReAsH。
活细胞显示出一种非凡的能力来划分它们的功能性生物化学。一个特别有趣的例子是细胞核。细胞核和周围细胞质之间的大分子交换不需要穿过脂质双分子层膜。相反,被称为核孔的大蛋白质通道穿过核膜,并调节其他蛋白质和RNA分子的通过。除了简单的门控扩散,核孔和相关转运受体系统能够产生大量的浓度梯度,以鸟苷三磷酸水解的能量为代价。与传统的分离方法(如反渗透和透析)相比,生物系统连续运行,不应用压力或溶剂交换的循环变化。摘要生物学范式,我们检查这个运输系统作为一个热力学机器的溶液分解。在建立自由能转导和生化动力学的基础上,我们发现了浓度梯度作为熵产形式的耗散函数的稳定运行和优化的条件。
草从土壤中吸收硅酸,并将其作为固体二氧化硅沉积在叶子中。这种矿物质占草干重的1-10%,提高植物对各种胁迫的耐受性。促进耐应力的机制大多是未知的,甚至对矿化过程也知之甚少。为了研究高粱叶片矿化,我们通过原位炭化和空气扫描电子显微镜观察了表皮二氧化硅细胞的二氧化硅沉积。我们的发现与二醋酸荧光素染色测试的二氧化硅细胞的活力相关。我们将我们的结果与根吸收硅酸缺陷的高粱突变体进行了比较。我们通过检测暴露于硅酸的叶片中的正常矿化,表明这些植物的叶片硅化是完整的。当硅酸冷凝成二氧化硅时,硅细胞是可活的。受控矿物沉积与水蒸散无关。光漂白后的荧光恢复表明,形成的矿物符合纤维素细胞壁,使细胞质与邻近细胞良好连接。 As the silicified wall thickened, the functional cytoplasm shrunk into a very small space. These results imply that leaf silica deposition is an active, physiologically regulated process as opposed to a simple precipitation.
2016
有孔虫是海洋原生动物,广泛分布在世界各地的海洋中。了解有孔虫的生物矿化途径尤为重要,因为它们的钙化壳是全球碳酸钙生产的主要组成部分。本文介绍了一种结合低温扫描电镜、低温荧光成像和低温eds的相关方法。该方法应用于底栖有孔虫属Amphistegina的离子转运过程研究。我们确认了之前在完整和部分脱钙的Amphistegina lobifera标本中发现的大型海水液泡的存在。我们观察到相对较小的囊泡被钙黄素强烈标记,还在细胞质中以及在大的海水液泡中发现了富含镁的矿物颗粒。低温显微镜与元素微量分析和荧光成像的结合揭示了有孔虫生物矿化途径的新方面,迄今为止,这在生物矿化领域是独一无二的。这种方法同样适用于其他生物生物矿化途径的研究。(C) 2016年爱思唯尔公司版权所有。
最近发现,当在哺乳动物细胞中表达时,黄嘌呤(YFP变体)和人铁蛋白(h链)之间的融合结构形成微米大小的超分子组装。组装过程是由弱疏水相互作用导致YFP二聚。蛋白质的组装可以在基因水平上通过突变的主要序列来抑制。在这项工作中,我们描述了对细胞中氧化还原状态敏感的自组装界面的工程。YFP的关键疏水残基系统突变为半胱氨酸。在某些情况下,黄嘌呤-铁蛋白结构的超分子组装通过形成二硫键来代替疏水相互作用而得以保存。在其他情况下,组装被取消,导致表达蛋白的弥散分布。一种在正常减少细胞内条件下仍保持弥散的特定变体被发现在暴露于硫醇特定的氧化试剂后迅速自组装。
在卤化物钙钛矿半导体中,通过低温、低能加工实现高质量的光电性能是前所未有的。了解这些半导体形成化学的独特方面是通过简单的制备程序了解高质量材料的起源的关键一步。卤化物钙钛矿的制备方法工具箱发展迅速。典型的反应是在碘化铅(PbI2)和碘化甲基铵(CH3NH3I,缩写. MAI)之间形成钙钛矿CH3NH3PbI3 (MAPbI(3)),我们在本工作中讨论。我们研究了通过两种常用的合成工艺将小的单晶PbI2晶体转化为MAPbI(3):与MAI在溶液中反应或以蒸汽形式反应。PbI2前驱体的单晶性质允许对前驱体和最终产物之间的关系做出明确的结论,阐明了先前未观察到的反应过程方面。通过原位光致发光显微镜,我们发现溶液中的反应通过孤立的成核事件开始,然后从核生长。我们通过x射线衍射和形态表征观察到,溶液反应的MAPbI(3)产物的最终阶段与初始PbI2晶体之间存在很强的取向和结构关系。在所有这些测量中,我们发现反应不会在一定的MAI阈值浓度以下进行,这使得广泛使用的合成过程中形成的自由能首次实验确定为0.1 eV。从这些结论中,我们提出了一个关于反应途径的更详细的假设:我们的结果表明,溶液中的反应始于拓扑取向成核事件,随后是颗粒生长和溶解-重建。 By similar techniques, we find the reaction via vapor phase produces
我们利用时移荧光显微镜评估了阳离子脂介导转染蛋白表达和细胞分裂之间的时间关系。详细的图像分析在单细胞水平上提供了新的见解,同时实现了适当的统计。通过流式细胞术等不太直接的方法获得的早期证据表明,涉及核膜破裂的主要转染途径,但也提示存在独立于有丝分裂的途径。我们确认并量化了这两种机制。我们发现成功转染的时间出乎意料地灵活,这与时间窗口狭窄的说法相反。具体来说,暴露于转染培养基后24小时以上分裂的细胞表达的探针蛋白水平与转染期间或转染后不久处于有丝分裂状态的细胞相当。这一发现将对非病毒基因传递材料的指导和开发产生深远的影响。(C) 2016年由Elsevier Inc.出版。
电子显微镜为理解生物分子、细胞和组织的结构做出了巨大贡献。一般来说,最忠实地保存生物标本和其他软有机材料是通过低温固定来实现的。包埋介质是天然的水环境本身,通过快速或加压冷却以玻璃化形式固定。直到最近,通过电子冷冻显微镜对这种玻璃化薄标本的成像几乎等同于宽视场透射电子显微镜(TEM)。一些新的方法已经进入低温显微镜领域,包括软x射线成像,聚焦离子束扫描电子显微镜的串行表面成像,相板和扫描TEM (STEM)。在这篇文章中,我们专注于STEM方法及其对生物冷冻显微镜的适应性。通过STEM对未染色标本进行低温成像提出了具体的挑战。长期以来,困难被认为是不可克服的,潜在的优势也被低估了。实验装置和探测器技术的未来发展将允许将该方法扩展到更厚的样品,提高分辨率和分析能力。
哺乳动物细胞动力学脱落是由ESCRT膜裂变机制介导的。虽然通过高分辨率显微镜已经阐明了许多关于脱落的拓扑和动力学,但关于脱落机制的关键问题仍然是开放的。在这里,我们应用低温软x射线断层扫描来阐明连接细胞脱落的细胞膜桥的新的超微结构细节。特别是,我们解决了EM无法到达的中部暗区内明确的环状结构,并确定了脱落部位的膜挤压。在脱落后期的细胞中,我们分析了一组复杂的螺旋螺旋,扩展了EM获得的结构信息。我们的结果突出了软x射线断层扫描的优势,并强调了使用互补方法来表征细胞结构的重要性。值得注意的是,通过提供完整细胞的新结构数据,我们提出了关于脱落拓扑的现实观点,并提出了ESCRT介导的脱落的新机制模型。
我们最近证明,冷冻扫描透射电子断层扫描(CSTET)在高倾斜度和较厚的标本上提供玻璃化细胞的层析重建,具有更好的信息传输(Wolf et al., 2014)。在cryoSTEM中,电子束穿过样品后没有形成图像的透镜;检测是非相干的,非弹性散射的电子提供可用的对比信息。通过消除零损失能量过滤的需要,STEM模式提供了有效的电子剂量使用,从而最大限度地减少样品损伤。在这里,我们演示了使用CSTET在未染色、未固定和未切片的培养成纤维细胞中获得高度详细的细胞器和大分子复合物的3D结构,同时从高角度、非相干散射电子中收集分析信息。作为一个恰当的例子,cryoSTEM断层扫描显示了线粒体中隔离的致密沉积物的特征模式。这些沉积物的能量色散x射线(EDX)光谱显示了钙和磷。一旦进行了元素识别,STEM散射信号就可以定量地解释为线粒体钙沉积的三维地图。这种方法可以扩展到识别和绘制细胞中比普遍存在的碳、氮和氧更重的其他元素浓度,正如我们在细菌细胞中演示的磷(Wolf et al., 2015)。这项研究提供了一个例子,说明如何在整个细胞中对原子序数敏感的成像将通过将元素组成与细胞器形态相关联,为结构细胞生物学提供一个新的维度。
2015
细菌细胞通常含有致密的颗粒。其中,聚磷酸盐体(PPBs)储存无机磷酸盐,具有多种基本功能。到目前为止,PPBs的鉴定是通过需要干燥或化学固定细胞的分析方法完成的。这些方法需要大的电子剂量,与低温标本的低剂量成像不兼容。我们在这里表明,扫描透射电子显微镜(STEM)完全水合,完整的,玻璃化的细菌提供了一个简单的方法,基于电子散射对原子序数的定量敏感性的含磷致密颗粒的映射。散射角的粗分辨率将磷与大量较轻的原子(碳、氮和氧)区分开来。其理论基础类似于材料科学的Z对比。EDX提供了磷的阳性鉴定,但重要的是,该方法不需要涉及比成像所需的更严重的电子剂量。当元素身份从生物学背景中已知时,该方法一般适用于低温保存标本中的重元素映射。生物细胞主要由氢、碳、氮和氧等轻元素组成。 Heavier elements are also present in smaller quantities, e.g., calcium, magnesium, phosphorous, and iron. In certain contexts these may accumulate in specific cellular bodies or granules. While imaging in the electron microscope reveals the morphology, analytical tools are required in order to determine the elemental composition. These tools put severe constraints on sample preservation and are generally incompatible with cryogenically fixed specimens due to excessive irradiation by the electron beam. In this work we analyze phosphate-rich granules in intact, cryogenically-fixed bacteria using scanning transmission electron microscopy (STEM). Focused electrons are scattered to a range of an
基于铁蛋白和黄嘌呤(YFP)融合结构的超分子蛋白组合(SMPAs)的基因编码系统从哺乳动物转移到细菌宿主。组装过程被揭示是独立于表达宿主,而尺寸和水平的顺序组装结构受到宿主生物体的影响。在纯化过程中观察到额外的相互作用水平,即预先形成的smpa之间的合并。SAXS研究表明,在聚结过程中,单个smpa的局部秩序得以保留。最后,朝性剂尿素有效地破坏了宏观聚结和纳米尺度上的相互作用,直到形成单铁蛋白笼。
完整的玻璃化细胞的冷冻断层摄影术提供了其结构和组织的三维视图,以快照的生活状态。由于缺乏重金属染色,倾斜系列图像通常由离焦相位对比产生。最近,许多其他方法被引入用于三维冷冻成像。这些技术包括相板成像、软x射线断层扫描、聚焦离子束扫描电子显微镜的连续表面成像和冷冻stem断层扫描(CSTET)。在这里,我们解释了STEM设置的基础,并演示了CSTET研究不固定的、完全水化的哺乳动物细胞的能力。在CSTET重建中可以识别许多细胞特征,包括膜、囊泡、细胞骨架、细胞外基质、包被凹和核糖体。STEM信号采集配置比离焦相位对比更灵活,对原始图像施加的空间滤波要轻得多。由于保留了较低的空间频率信息,STEM层析成像重建更忠实地反映了试样中的质量密度分布。
VirE2是农杆菌对寄主进行遗传转化的主要分泌蛋白。它与一个小的酸性伴侣VirE1共表达,可以阻止VirE2的寡聚。在分泌到宿主细胞后,VirE2起到类似于病毒衣壳的功能,在通往细胞核的途中保护单链转移DNA。VirE2与ssDNA的结合是强合作的,而且依赖于蛋白-蛋白相互作用。为了分离蛋白质-DNA相互作用,使用长度与蛋白质结合足迹相当的表面固定化DNA底物进行了成像表面等离子体共振(SPRi)研究。结合曲线显示了底物刚性的重要影响,显著偏好poly-T序列,与poly-A和双链DNA片段均无结合。在高盐浓度下的解离证实了相互作用的静电性质。VirE1-VirE2异源二聚体也与ssDNA结合,但结合机制不同,对高盐不敏感。VirE2和VirE1-VirE2均不遵循可逆单体结合的Langmuir等温线。这些差异反映了被VirE1抑制的VirE2的合作自相互作用。
2014
志贺氏菌通过内化进入上皮细胞形成液泡。随后的液泡膜破裂允许细菌逃逸到细胞质中进行复制和细胞间传播。细菌效应因子如IpgD,一种产生PI(5)P并改变宿主肌动蛋白的PI(4,5)P2磷酸酶,促进了这种内化。在这里,我们通过高含量siRNA筛选确定了参与志贺氏菌摄取和液泡膜破裂的宿主蛋白,随后重点研究了循环室的组成部分Rab11。Rab11阳性囊泡在液泡破裂前被招募到侵袭部位,Rab11的敲除显著减少液泡膜破裂。此外,ipgD突变体不能将PI(4,5)P2去磷酸化为PI(5)P, Rab11招募缺失,液泡破裂延迟。rab11阳性囊泡的超微结构分析进一步揭示,含有ipgD突变体的空泡被限制在肌动蛋白结构中,这可能导致延迟空泡破裂。这些发现为志贺氏菌入侵液泡进展和破裂的潜在分子机制提供了见解。
完全水化、玻璃化生物标本的冷冻电子断层扫描(CET)已成为生物学研究的重要工具。对于细胞研究,传统的透射电子显微镜成像方式对样品厚度有严格的限制,因为它依赖于相位相干来产生对比。在这里,我们证明了使用扫描透射电子显微镜对未染色的玻璃化标本(CSTET)进行冷冻断层扫描的可行性。我们比较了CSTET和CET对整个细菌和人类组织培养细胞的成像,发现在CSTET重建中有良好的对比度和细节。特别是在高样本倾斜时,CSTET信号比能量滤波的CET相位对比图像包含更多的信息数据,从而提高了深度分辨率。谨慎地控制剂量的传递,允许在可观察到的束损伤开始之前有相对高的累积照射。可接受标本厚度的增加扩大了电子冷冻层析成像的适用性。
基因编码的超分子蛋白组装体(SMPAs)是通过结合不同的自组装特性在活细胞中诱导形成的。单个融合结构包含编码人铁蛋白重链(H)和黄嘌呤荧光蛋白的基因,后者暴露出弱二聚体界面,以及核定位信号。在HeLa细胞中表达后,体内共聚焦荧光和差分干涉对比成像显示SMPA结构仅在细胞核中扩展。集合典型的圆形,呈牙槽状,贝壳状或杂交结构。透射电子显微镜显示有晶体填料。黄嘌呤二聚界面的定点突变阐明了SMPA的形成机制。这些组成蛋白保留了铁结合和荧光发射的活性,从而为具有特定生化功能的合成细胞体的形成提供了一般策略。
2013
疟疾色素疟原虫色素的结晶隔离了受疟原虫感染的红细胞(rbc)中血红蛋白消化的有毒血红素副产物。最近,我们应用电子和x射线成像和衍射方法来阐明这一过程。在寄生的红细胞中,我们观察到恶性疟原虫消化液泡(DV)膜表面的晶体以{100}面为方向。滋养体期寄生虫的软x射线层析成像(SXT)图像的建模表明DV膜厚度为4-16 nm,这表明它可能是脂质多层膜的作用。在这里,我们通过x射线吸收对滋养体SXT图像进行定量分析,以绘制DV膜厚度。根据脂质的化学结构和晶体密度,我们发现主要是4.2 nm厚的双分子层,其余的解释为类似8 nm厚的斑块。电子显微图像分析也产生了4-5纳米DV膜厚度。因此DV脂膜主要是双分子层,因此诱导的疟原虫色素成核主要通过膜的两个小叶内部发生。我们认为,这种含有含有合适OH或NH头基团的单酰和双酰脂质的单叶可能通过立体化学和晶格匹配的方式催化疟原虫色素成核,涉及类似100个分子的二维成核聚集。
核输入和输出通常被认为是逆向过程,即转运受体通过核孔运送蛋白质货物。与输入相反,受体与核RanGTP的可逆结合导致平衡的双向交换,由ran结合的GTP的生理不可逆水解终止输出导致单向运输。我们提出了一个简明的数学模型,预测蛋白质分布和受体介导的核输出的动力学速率,进一步显示出一个意想不到的伪线性关系。模型的预测通过渗透和活细胞测量得到验证。
细胞核和细胞质之间的分子交换是真核细胞生物学最基本的特征之一。核孔作为这种运输的管道,既用于自主通过孔的货物,也用于需要中间受体进行易位的货物。这类受体的主要类别是由小的GTPase Ran调节,通过其相互作用,核-细胞质运输系统作为一个选择性分子泵功能。我们提出了一个简单的运输分析模型,包括易位和受体结合动力学。该模型适用于光漂白后荧光恢复等稳态动力学。时间常数表现为参数的组合,其对测量动力学的影响是不可分离的。竞争性货物结合受体和大的细胞质容量缓冲任何特定货物的运输性质。解决方案的具体限制提供了定性的见解和细胞背景下的核输运的解释。最重要的是,我们发现在现实条件下,受体结合,而不是核孔的渗透性,可能是核-细胞质交换的速率限制。
农杆菌以向植物转移基因而闻名。除了线性ssDNA寡核苷酸外,农杆菌还分泌丰富的ssDNA结合效应物VirE2。在许多方面,VirE2适应偶联机制转化真核宿主。VirE2的晶体结构是由一个柔性连接体连接的两个紧密结构域。与ssDNA结合,VirE2形成一个有序的螺线管壳,或衣壳称为t复合体。在这里,我们提出了一个三维重建的VirE2-ssDNA复合物使用冷冻电子显微镜和迭代螺旋实空间重建。由于蛋白质结构固有的异质性,高分辨率的细化是不可能的。通过计算建模、化学修饰、质谱和电子顺磁共振的结合,我们发现n端结构域受到切向和纵向链接的紧密约束,而C端则受到弱约束。因此,四元结构在保持局部柔性的同时被刚性地组装起来。这种灵活性可能对适应没有序列特异性的底物很重要。
恶性疟原虫是人类疟疾中最致命的一种,其核外周因其在毒力基因表达中扮演亚核隔室的角色而引起了广泛关注。最近的数据表明,核膜的组成部分在调节基因表达在一些真核生物。特别注意了构成核孔复合物(NPC)的核孔蛋白。然而,人们对疟原虫核膜的组成知之甚少。在这里,我们描述了PfSec13,一种不寻常的恶性疟原虫核孔蛋白,它显示出独特的结构相似性,这表明它是酵母的Sec13和Nup145C的融合。通过超分辨率荧光显微镜(3D-SIM)和体内成像,我们发现PfSec13在寄生虫红细胞内发育过程中的动态定位与npc的动态定位一致,并且这些动态与微管而不是F-actin相关。此外,PfSec13不与异染色质标记HP1和H3K9me3共定位,这表明npc的位置是纯色的。与PfSec13相关的蛋白质表明这种不寻常的Nup参与了几个细胞过程。事实上,超微结构和染色质免疫沉淀分析显示,除了npc之外,PfSec13还存在于与染色质相关的核质中。最后,我们使用肽核酸(PNA)下调PfSec13,并表明它是人体红细胞中寄生虫增殖所必需的。
软x射线冷冻显微镜(cryo-XT)为电子冷冻显微镜(cryo-EM)提供了理想的补充。Cryo-XT适用于比cryo-EM厚一个数量级以上的样品,尽管分辨率更低,只有几十纳米。此外,通过有机物和水的不同吸收,在“水窗口”中获得的自然对比产生了细胞器、膜、蛋白质复合物和其他细胞成分的详细图像。因此,Cryo-XT非常适合于真核细胞的断层扫描。然而,样品厚度的增加对样品制备提出了更严格的要求。低温em的标准方法,即骤降到低温流体,如液态乙烷,不再理想地适合于获得用于低温xt的厚样品的玻璃化。高压冷冻是一种替代方法,与冷冻替代和包埋密切相关,或与玻璃体切片的电子冷冻显微镜(ceemovis)密切相关。我们在这里表明,高压冷冻可以适用于整个玻璃化样品的软x射线断层扫描,产生了一种高度可靠的方法,可以避免结晶伪影,并可能在不适合垂直冷冻的样品中提供更好的成像条件。(C) 2012年Elsevier公司版权所有。
2012
血红素解毒是引起疟疾的寄生虫生命周期中的一个关键步骤,通过结晶成生理上不溶性的疟原虫色素来实现。这种成核模式对于理解抑制疟原虫色素生长的抗疟药物的作用机制具有深远的意义。有几行证据表明,酰基甘油脂类参与成核过程。已报道在脂质纳米球内形成疟原虫色素晶体;另外,在体外已经发现它们在酰甘油脂-水界面成核。我们应用低温软x射线断层扫描和三维电子显微镜来研究消化液泡(DV)内疟原虫色素晶体的位置和方向,作为其成核和生长过程的标志。低温软x射线断层扫描在“水窗口”是特别有利的,因为对比生成本质上是基于原子吸收。我们发现疟原虫色素的成核发生在DV的内膜上,结晶发生在水相而不是脂相。晶体形态表明一个共同的{100}朝向膜,正如预期的模板形核。这与x射线荧光和衍射在一项配套工作中得出的结论一致。 Uniform dark spheres observed in the parasite were identified as hemoglobin transport vesicles. Their analysis supports a model of hemozoin nucleation primarily in the DV. Modeling of the contrast at the DV membrane indicates a 4-nm thickness with patches about three times thicker, possibly implicated in the nucleation.
2011
最致命的人类疟疾是由原生动物寄生虫恶性疟原虫引起的。这种寄生虫复杂的生命周期与基因表达的严格转录调控有关。核定位和染色质动态可能在恶性疟原虫毒力基因调控中起重要作用。我们应用了一种新兴的电子显微镜技术,在受感染的红细胞内构建了处于不同发育阶段的寄生虫核的3D模型。我们跟踪了整个红细胞周期内核孔和染色质的分布,发现了核孔分布和染色质组织之间的显著耦合。孔隙动力学涉及子细胞的聚类、生物发生和分裂,而染色质在包装过程中经历了依赖于阶段的变化。异染色质分布的显著变化与先前确定的分裂分裂中后期基因表达和核小体定位的转变相一致。我们还发现了常染色质在核膜上的定位与核孔的局部分布之间的相关性,以及分裂期间的动态核极性。这些结果表明,寄生虫发育过程中基因表达的循环模式与细胞和核结构的总体变化相关。
2009
在许多类型的病毒感染、转染、植物病原菌农杆菌的基因转移和基因治疗策略中,DNA传递到细胞核是一个必不可少的步骤。因此,DNA穿过核孔复合体(NPC)的机制是非常有趣的。利用爪蟾卵提取物体外重建的细胞核,我们之前使用基于光镊的单分子方法研究了DNA通过核孔的途径。荧光标记的DNA分子也被发现在细胞核内积累。在这里,我们发现这种DNA的输入依赖于输入蛋白家族的可溶性蛋白受体。为了鉴定这种受体,我们在竞争研究中使用了不同的途径特异性货物以及从核孔蛋白Nup153衍生的途径特异性显性负性抑制剂。我们发现抑制受体转运蛋白可以抑制DNA的输入。相反,抑制输入素β对DNA的核积累影响不大。在使用渗透化HeLa细胞和哺乳动物细胞提取物的实验中,完全证实了对转运蛋白的依赖。我们得出结论,在这些不同的脊椎动物系统中观察到的DNA的核输入在很大程度上是由受体转运蛋白介导的。 We further report that histones, a known cargo of transportin, can act as an adaptor for the binding of transportin to DNA.
在真核细胞中,核孔支持细胞质和核之间的分子通信。蛋白质的选择性转运是由可溶性受体介导的,可溶性受体由小的GTPase Ran调节,导致货物在细胞核内积聚或从细胞核中耗尽,即核输入或核输出。我们通过分析和实验相结合的方法来考虑这个传输系统的运行。对一个简单模型的挑衅性预测进行了测试,使用的是在非洲爪蟾卵提取物中重建的无细胞核,该系统非常适合定量研究。我们发现,积累能力是有限的,因此一种进口货物的引入导致另一种进口货物的出口。显然,孔隙本身并不能决定运移方向。在稳态状态下,不同负载物的核质比趋于一致。该模型表明,这一比例实际上应该独立于受体-货物亲和力,尽管动力学可能受到强烈影响。系统组成部分的数值守恒突出了观测结果与流行的输运循环概念之间的冲突。我们认为化学分配提供了一个框架来理解通过平衡受体-货物中介产生浓度梯度的能力。 [DOI: 10.2976/1.3080807]
聚合物通过比水动力直径更窄的孔隙时受到限制的熵惩罚的阻碍。这可能通过与孔壁的吸引相互作用来平衡。我们发现氢键聚合物,聚(异丙基丙烯酰胺)(pNIPAM),很容易通过聚碳酸酯轨道蚀刻膜的狭窄孔隙扩散。pNIPAM的电子侧积累遵循拉伸指数行为。相比之下,一个小得多的右旋糖酐以相当或更慢的速度扩散,并表现出普通的菲克样行为。通过对pNIPAM表面吸附和化学接枝对孔隙的影响的比较,指出弱聚合间键是加速传输的表面相互作用的来源。我们将结果解释为pNIPAM在孔隙内异常扩散的证据。
2008
胞间连丝(Pd)是跨壁膜通道,允许代谢物和其他小分子、蛋白质、rna和信号分子的细胞间运输。细胞质可溶性大分子的转运是相邻细胞之间的电化学梯度、相邻细胞之间每个界面的Pd数、斯托克斯半径(R(S))、细胞质环的面积和通道长度的函数。能通过Pd的最大分子的大小决定了Pd尺寸的排除极限。然而,由于分子的形状和大小决定了它通过孔或管扩散的能力,R(S)是一个更好的衡量标准。相对较小的R(S)变化会引起分子探针流动性的较大差异,特别是当孔径与探针的孔径接近时。此外,随着大分子的尺寸接近通道的尺寸,膜电荷效应可能变得重要。我们利用定量工具和分子建模测量了Pd, C(Pd)的表观电导率系数,用于大分子的非靶向输运。利用该方法研究了蛋白质电荷和R(S)对本色烟C(Pd)的影响。本文测定了与天然绿色荧光蛋白大小不同但带相同电荷的改性绿色荧光蛋白(GFP)和带更多负电荷的衍生物的C(Pd)。我们发现,细胞质可溶性GFP和修饰GFP的细胞质形式的C(Pd)与R(S)的相关性最强,并且带负电荷的GFP衍生物的C(Pd)的明显异常增加至少部分是R(S)上的电荷效应的结果。
异常的神经元迁移表现为脑畸形,如无脑畸形。协调细胞运动的损伤可能反映了细胞极化或极化与运动之间耦合的错误机制。在这里,我们报道了极性激酶MARK2/Par-1与其底物(众所周知的无脑相关基因双皮质蛋白(DCX))在皮层径向迁移过程中的关系。我们之前已经证明,使用子宫电穿孔降低MARK2水平导致多极神经元停滞在中间区边界,类似于DCX沉默情况下观察到的表型。然而,MARK2的减少稳定了微管,我们在这里表明,DCX的敲除增加了微管动力学。这导致了一种假设,即同时减少可能减轻表型。MARK2和DCX的共同减少导致体内正常神经元迁移表型的部分恢复。中心体的动力学行为反映了任一种蛋白被还原时激活的不同分子机制。在MARK2减少的情况下,中心体的加工运动性受到阻碍,而当DCX减少时,中心体快速但双向移动。我们的结果强调了极性途径和细胞质动力蛋白依赖性活动之间成功耦合的必要性,以实现适当的神经元迁移。
核孔复合物是真核细胞中普遍存在的一种大型蛋白质通道。它在细胞核和细胞质之间产生重要的大分子分离。转运机制依赖于受体蛋白对分子货物的识别,以及受体与气孔之间的特异性相互作用。我们提出了这种“受体介导”运输的化学模拟,使用改性的纳米多孔膜过滤器,聚异丙基丙烯酰胺作为载体分子或受体,单链DNA作为货物。我们发现,ssDNA和聚异丙基丙烯酰胺的复合物比裸ssDNA在修饰后的孔隙中扩散得更快,尽管复合物的尺寸更大。因此,该可移动聚合物作为一种可溶性受体,引导大分子货物特异性地通过孔。
利用分析工具和计算机模拟从理论上研究了无序微管网络中马达蛋白在微管上的小货物颗粒的运动。考虑了二维和三维的不同网络拓扑结构,其中之一最近由Salman [Biophys]进行了实验研究。[j].中国科学,2007(2)]。对随机速度模型进行了推广,推导出货粒的均方位移。我们发现所有的情况都属于异常超扩散的一类,它主要对网络的维数敏感,而对网络的拓扑结构不太敏感。然而,在三维空间中,这种运动非常接近于简单的扩散,并具有依赖于网络拓扑结构的亚对数修正。当考虑体积溶液中热扩散的细节时,没有发现渐近时间行为的显著变化。然而,平均微管极性的微小不对称影响了相应的长时间行为。我们还研究了活动物细胞中微管网络的三维模型。针对不同的运动加工能力,模拟和分析了细胞内运输的三个首次通过时间问题:(i)源自细胞核附近的货物必须到达细胞膜,(ii)源自细胞膜的货物必须到达细胞核,以及(iii)离开细胞核的货物必须到达细胞质中的特定目标。 We conclude that while a higher motor processivity increases the transport efficiency in cases (i) and (ii), in case (iii) it has the opposite effect. We conjecture that the balance between the different network tasks, as manifested in cases (i) and (ii) versus case (iii), may be the reason for the evolutionary choice of a finite motor processivity.
农杆菌通过水平基因转移机制侵染寄主植物。这种能力已导致其广泛应用于人工基因转化。除了DNA,该细菌还提供丰富的ssDNA结合蛋白VirE2,其在宿主中的作用包括保护免受细胞质核酸酶的影响和适应核输入。在农杆菌中,VirE2与它的酸性伴侣VirE1结合。在缺乏VirE1的体外表达时,VirE2易于寡聚并形成无序的丝状聚集体。在ssDNA存在的情况下,这些细丝采用有序的螺线管形式,之前通过电子显微镜和三维图像处理对其进行了表征。在体外,VirE2与VirE1共表达形成可溶性异源二聚体。因此,VirE1阻止了VirE2的寡聚,并与它与ssDNA的结合竞争。我们在这里展示了VirE2与VirE1配合物的晶体结构,表明VirE2由两个独立的结构域组成,呈现出一种新颖的折叠,并由一个柔性连接子连接。与VirE1的静电相互作用将VirE2的两个结构域固化为锁定形式。 Comparison with the electron microscopy structure indicates that the VirE2 domains adopt different relative orientations. We suggest that the flexible linker between the domains enables VirE2 to accommodate its different binding partners.
病毒通过胞间连丝(Pd)传播是由病毒编码的运动蛋白(MPs)介导的,这些蛋白可以修饰胞间连丝的结构和功能。烟草花叶病毒(MP)-M-TMV的MP是内质网(ER)整合膜蛋白,与病毒RNA (vRNA)结合,形成vRNA:MP:ER复合物。有人假设TMVMP导致Pd扩张,从而增强了细胞骨架介导的vRNA:MP:ER复合物通过Pd的滑动;相反,在没有MP的情况下,ER不能通过Pd。另一种模型提出,细胞间的扩散发生在穿过Pd的ER膜中的MP:vRNA复合物的扩散。为了测试这些模型,我们测量了(MP)-M-TMV和复制酶表达对几种绿色荧光蛋白融合探针的细胞间扩散的影响:一种可溶性细胞质蛋白,两种ER管腔蛋白和两种ER膜结合蛋白。我们的数据支持扩散模型,其中包含ER嵌入MP、vRNA和其他成分的复合物在受感染细胞和邻近未感染细胞之间的浓度梯度的驱动下,在Pd内的ER膜中扩散。这些数据还表明,病毒复制酶和MP在改变Pd电导率方面共同起作用。
2007
蛋白质和rna的核质交换是由受体介导的,受体引导它们的货物通过核孔。每个货物上的肽定位信号决定了它将与哪些受体相互作用。这些相互作用通常由小的GTPase Ran调节。GTP的水解提供了所需的化学能,以创建一个真正的热力学泵,选择性和定向地在核膜上积累其底物。一种普遍的看法是,货物传递是不可逆的,例如,输入到细胞核的蛋白质除非可能通过特定的输出受体,否则不会返回细胞质。利用非洲爪蟾卵提取物中重建的无细胞核进行定量测量表明,核积累遵循一级动力学,并在遵循细胞质货物浓度Michaelis-Menten函数的水平上达到稳态。这种饱和表明受体介导的核孔易位是双向发生的。光漂白后的荧光恢复和胞浆介质的交换直接证明了积累的可逆性。基于我们的结果,我们提供了一个简单的生物物理模型来预测观察到的行为。一个影响深远的结果是,核定位信号决定了一个蛋白质群体的命运,而不是承担它的单个分子的命运,这些分子仍然可以自由地来回穿梭。 This implies an open communication between the nucleus and cytoplasm and a ubiquitous mechanism for signaling in both directions.
农杆菌通过DNA转移感染植物细胞。这一过程中的一个关键因素是细菌毒力蛋白VirE2,它在化学计量学上与运输的单链(ss) DNA分子(t链)相关联。在体外通过透射电镜观察到,VirE2-ssDNA很容易形成一个延伸的螺旋复合体,其结构非常适合DNA保护和核导入的任务。在这里,我们阐明了特异性分子伴侣VirE1在调节VireE2-VirE2和VirE2-ssDNA相互作用中的作用。VirE2单独形成能够与ssDNA结合的功能性丝状聚集物。相反,与VirE1共表达产生单分散的VirE1- vire2配合物。VirE2与ssDNA的协同结合释放了VirE1,导致了螺旋复合物的受控形成机制,而大分子聚集进一步促进了螺旋复合物的形成。基于这一体外实验证据,我们认为VirB通道的受限体积为VirE2从VirE1到t链的结合交换提供了一个自然位点。
2006
2005
在有核细胞中,设计用于核输入的蛋白质在穿过核膜易位之前与可溶性核转运受体形成复合物。运输的方向性是由于Ran蛋白的不对称分布,它只以核RanGTP形式解离进口货物复合物。利用荧光相关光谱研究了在RanGTP存在和不存在时货物配合物在溶液中的稳定性。我们发现,当输入蛋白α不携带货物时,RanGTP对主要输入受体输入蛋白α / β异源二聚体具有更高的亲和力,这表明一些核转运靶点可能被优先释放。
真核细胞中的许多基本过程依赖于它的两个主要隔间,细胞质和细胞核之间的调节分子交换。一般来说,大分子复合物的核输入依赖于特定的肽信号及其通过核孔介导易位的受体的识别。在这里,我们解决了承载这种核定位信号的蛋白产物如何在输入前到达核膜的问题,即通过简单的扩散,或者可能在细胞骨架元件或细胞骨架相关运动蛋白的帮助下。使用直接单粒子跟踪和详细的统计分析,我们表明,核定位信号的存在引发了无细胞爪蟾卵提取物中微管的主动转运。负端定向细胞质动力蛋白的化学和抗体抑制阻断了这种主动运动。在完整的细胞中,微管从中心体向外放射,这样的相互作用将有效地将核靶向货物运送到核膜,为进口做准备。
IV型分泌系统(T4SSs)被各种细菌用来将蛋白质和DNA分子输送到广泛的靶细胞。其中包括直接参与发病机制的系统,如百日咳博德特氏菌将百日咳毒素分泌到人体细胞中,以及农杆菌将单链DNA (ssDNA)输送到植物中。这些复杂的系统由横跨细菌细胞质的蛋白质组成。农杆菌T4SS由12种毒力蛋白组成,并将其转移的ssDNA和几种毒力蛋白底物传递到多种真核细胞。最近对农杆菌T4SS的研究揭示了关于其蛋白质在细菌中的定位和结构,其运输信号的生化特性,DNA底物通过分泌系统的路径,以及该系统与其宿主的初始接触点的新信息。这些发现扩展了我们对T4SSs的结构和功能的认识和理解。
2004
用整体平均法分析复杂化学和生物系统的局限性可以被单分子实验所克服。在这里,我们使用单分子技术来区分一个关键生物过程的两种被普遍接受的机制——由分子效应物激活蛋白质。这两种机制,即诱导拟合和种群迁移,通常难以用整体方法加以区分。作为一个模型,我们重点研究了核转运效应子RanBP1和两个相关复合物之间的相互作用,这两个复合物包括核输入受体,输入素β,以及小GTPase的GDP-或gppnhp结合形式Ran。我们发现效应器的识别通过诱导拟合或种群移位机制进行,这取决于基底,并且这两种机制可以通过数据进行区分。
农杆菌通过一种涉及跨界遗传转移的独特机制感染植物细胞。单链DNA底物与细菌毒力蛋白VirD2和VirE2一起穿过两个细胞壁。单个VirD2分子共价结合到单链DNA的5'端,而VirE2蛋白沿DNA长度进行化学计量结合,没有序列特异性。早期的透射/扫描透射电子显微镜研究表明,VirE2-DNA复合体具有螺线管(“电话线圈”)组织。在这里,我们报告使用电子显微镜和单粒子图像处理方法对该复合物进行三维重建。我们发现了一个中空的螺旋结构,外径15.7 nm,螺旋上升51.5 nm, 4.25个VirE2蛋白/圈。蛋白质单元的内表面包含一个连续的壁和一个向内突出的架子。这些结构似乎适合DNA结合。这种四元结构自然地将DNA从细胞质核酸酶中分离出来,并提示了一种通过宿主细胞因子修饰其核输入的机制。与螺旋结构共存的还有VirE2四聚体环结构。 A two-dimensional average of the latter confirms the major features of the three-dimensional reconstruction.
2003
真核生物核的组装包括三个不同的事件:膜募集,融合形成双核膜,核孔复合体(NPC)组装。我们报道了导入蛋白β负调控其中的两个事件,膜融合和NPC组装。当过多的输入素0被加入到一个完整的爪蟾核重建反应中,囊泡被招募到染色质上,但它们的融合被阻断。膜融合过程中导入蛋白β的下调是可逆的。事实上,过量的RanGTP (RanQ69L)单独刺激过度的膜融合,导致核膜内小管和细胞质环状层状结构。我们提出,一个精确的平衡的输入蛋白β Ran需要创建一个正确的双核膜,同时抑制不良的融合事件。有趣的是,截断的输入蛋白β 45-462允许膜融合,但产生的细胞核缺乏任何npc。这揭示了不同的进口-调节NPC组装。过量全长导入蛋白β和13 45-462在加入预熔核中间体时作用相似,即两者都阻碍NPC组装。NPC组装过程中GTPgammaS和bapta敏感步骤下游的导入蛋白β片段可被细胞质逆转。 Remarkably, it is not reversible by 25 muM RanGTP, a concentration that easily reverses fusion inhibition. This report, using a full reconstitution system and natural chromatin substrates, significantly expands the repertoire of importin P. Its roles now encompass negative regulation of two of the major events of nuclear assembly: membrane fusion and NPC assembly.
每分钟有数以百万计的大分子通过受体介导的转运在细胞核和细胞质之间进行交换。大部分的运输是由小的GTPase Ran控制的,它调节受体货物复合物在适当的细胞隔间中的组装和拆卸。本文应用动态力谱技术在单分子水平上研究了Ran与核输入受体importin beta1 (impbeta)的相互作用。我们发现配合物在两种不同黏附强度的不同构象状态之间交替。外部机械力的应用,通过降低州际活化能势垒的高度,使平衡向这些状态之一转移。另一种状态可以通过增加这种屏障的功能性Ran突变体来稳定。这些结果支持一个模型,即Ran imp的功能控制是通过预先存在的替代构象之间的种群转移来实现的。
RNA分子在许多生物过程中起着至关重要的作用,包括细胞内信息的存储和传递。这些事件是通过RNA-蛋白质相互作用或催化RNA分子介导的。现在已经认识到独特的RNA折叠与生物学功能有关。因此,为了研究调节RNA各种功能的内在结构变化和动力学,有必要探究其在溶液中的三维结构。在这方面,使用单分子方法可以对原生RNA分子进行独立于其大小的实时研究。然而,这可能需要将RNA固定在表面上。在这里,我们报道了一种在玻璃上固定RNA的新方法。该过程涉及长RNA分子的化学和酶修饰。此外,我们演示了光学镊子装置的应用来测量长度,因此,固定化完整的核糖体RNA分子的动力学作为不同溶液条件的函数。
介绍了一种在玻璃表面直接刻写碳的激光诱导光刻新方法,该方法从透明前驱体溶液中沉积。在激光光斑聚焦的玻璃-溶液界面处,发生微爆炸过程,导致纯碳沉积在玻璃表面。透射电子显微镜(TEM)分析显示两个不同的共存相。主要的一个显示了一个斑驳形态与典型的立方(sp(3))金刚石衍射。另一个区域显示了具有典型sp(2)键合碳衍射图样的有序石墨烯薄片阵列。sp(3)晶体的大小从9到30埃不等,随机分布在整个样品中。紫外拉曼光谱显示在预期金刚石峰的位置有一个宽频带,以及一个与石墨区域对应的峰。我们得出结论,图案碳是由纳米晶sp和sp(2)碳形式的混合物组成。
脊椎动物核孔复合物的大小是核糖体的30倍,由一个可溶性亚基库和两个膜蛋白组装而成。利用爪蟾核重建提取物的免疫衰竭,以前已经可以组装缺乏与蛋白质输入、输出或mRNA输出相关的孔亚基的核。然而,这些改变后的孔隙仍然具有孔隙结构的主体。在这里,我们使用抗体Nup85和Nup133(它的两个组成部分)免疫消耗单个亚单位,Nup107-160复合体。由此产生的重组核在NLS导入和DNA复制方面存在严重缺陷。引人注目的是,它们显示出每个测试的核孔蛋白都有严重缺陷。即使是完整的膜蛋白POM121和gp210也缺失或无组织。扫描电子显微镜显示无孔核,而添加Nup407-160复合物恢复功能孔。我们得出结论,Nup107-160复合物是脊椎动物核孔复合物组装的关键决定因素。
细胞膜对细胞质的区隔化对细胞内大分子的扩散有很大的影响,我们已经研究了荧光相关光谱(FCS)实验如何反映这一点。我们推导了由FCS测量的荧光粒子扩散到软膜附近的自相关函数,并表明它是两个贡献的总和:短时间尺度相关来自粒子的扩散(与自由扩散不同,因为存在障碍),而长时间尺度相关来自膜本身的波动(通过调节检测到的粒子数量来产生强度波动)。在热波动的情况下,第二种类型的相关性取决于膜的弹性。为了说明这个计算,我们报告了在囊泡膜附近进行的FCS实验的结果。测量的自相关函数显示非常清楚的两个预期的贡献,并允许恢复荧光团的扩散系数和表征膜波动的弯曲刚度。我们的结果表明,细胞内的FCS测量如果不认识膜的影响,会导致错误的扩散系数值。
在大多数考古遗址中,最具韧性的植物遗存是硅质植物岩——在植物生长过程中部分或完全硅化的特殊细胞。这些细胞具有特征性的形态,因此植物岩通常可以用来识别带到考古遗址的植物的分类亲和性。为了确定它们的用途,还需要其他分析手段。我们在这里提出了一种方法来区分燃烧和未燃烧的植物岩组合。该方法基于测量单个植物岩的折射率(RI)。即使来自单一植物的植物岩也有一定的RI值范围。对比燃烧和未燃烧的样品,我们证明了根据RI高于1-440的植物岩的比例来区分它们是可能的。这是简化测量模式的基础,只需要使用岩相光学显微镜和RI 1-440矿物油。我们将简化的方法应用于两个来自哈约尼姆洞穴(西加利利,以色列)的纳图夫人样本。(C) Elsevier Science Ltd. All rights Reserved.
使用荧光相关光谱,我们测量了核运输货物(标记有核定位信号的链霉亲和素)在活细胞的细胞质和细胞核中的表观流动性,并将其与标记有已知不支持核输入的核定位信号突变的链霉亲和素的流动性进行了比较,以及与一组不同大小的惰性分子(右旋糖酐)的流动性进行了比较。在细胞质中,运输货物的流动性被发现与它在细胞核中的流动性相比显著降低。或者用突变核定位信号标记链霉亲和素的移动性。这可以部分解释为,运输cango在细胞质中与两个核输入中介蛋白(进口蛋白α和进口蛋白β)形成复合物,但也可能部分归因于这一货物与细胞骨架的特定相互作用。
2002
我们报告了一项由活性蛋白质马达沿生物聚合物轨道驱动的粒子动力学的实验研究。我们使用非洲爪蟾卵的提取物,它在体外支持细胞骨架网络(微管和肌动蛋白丝)的形成,并提供粒子运动所需的所有生化因子。3 mum聚苯乙烯珠非特异性吸附马达蛋白,并作为运输底物。我们观察到一个增强的扩散运动与时间尺度的均方位移为t(3/2)。在最短的时间内,数据表明交叉到亚扩散或饱和状态,由于马达蛋白间歇粘附到微管。观察到这种行为的时间间隔差异很大。在抑制一种或另一种微管相关马达蛋白家族时,观察到这种饱和的时间间隔增加,但t(3/2)行为在较长时间内不受影响。(C) 2002 Elsevier Science B.V.版权所有。
我们研究了在一个活的真核细胞内由微管相关马达驱动的探针的运动。测量的2和3微米直径微球的均方位移在短时间内表现为增强的扩散缩放t(3/2),在长时间内明显交叉到普通或次扩散缩放,即t(γ)与γ小于或等于1。使用光镊子,我们试图在细胞内移动被吞没的珠,以便将异常扩散缩放与珠嵌入的网络密度联系起来。结果表明,直径为2和3微米的大珠粒必须主动地将细胞骨架丝推开才能移动,而直径为1微米的小珠粒可以在笼子里“嘎嘎作响”。1 mum珠也执行增强扩散,但较小和不一致的指数1.2相似的tot(3/4)。在小珠子的情况下,也可能有布朗贡献的运动,导致较小的指数。
2001
表面粘附粒子的向心运动是研究真核细胞表面动力学的一个经典实验系统。为了研究珠在整个细胞表面的迁移,我们开发了一种使用多核巨型成纤维细胞的实验测定方法,它提供了扩展的长度尺度和明确的参考系。用光学镊子将粘附配体刀豆蛋白A或纤维连接蛋白包被的珠子放置在细胞的特定位置,并随着时间的推移跟踪它们的后续运动。粘附,以及速度和方向性的运动,暴露了细胞质和膜的不同区域。珠子放置在周围的片上。启动向心运动,而放置在细胞中心部分的珠子附着在静止的皮层上而不移动。用互补的三维方法仔细检查表明,放置在细胞外围的珠粒在被吞噬进入细胞质后发生运动,而放置在细胞中心附近的静止珠粒则没有被吞噬。这些结果表明,粘附颗粒的向心运动可以发生在细胞内外。对肌动球蛋白活性的抑制被用来探索吞噬的要求和珠运动的各个方面。粘附颗粒的向心运动似乎依赖于不同于驱动整体细胞收缩力的机制。
核孔复合体是基因组、核环境和细胞质主要酶域之间的通道。核孔是穿过核膜两层的大通道,它控制着特定分子在细胞这两层之间的通道。它能够限制特定分子的通道,并进一步将它们泵入浓度梯度,这引发了有趣的物理问题。本文介绍了该生化泵的结构和运行的基本方面,它的热力学循环与传统机器不同。(C) 2001年科学院/科学和医学版Elsevier SAS。
基因转移到真核细胞需要摄取外源DNA进入细胞核。除有丝分裂期间外,分子进入核内部的途径仅限于通过核孔。在这里,我们通过荧光显微镜和单分子操作技术的结合,展示了扩展线性DNA分子的核摄取,使用后者实时跟踪单个分子的摄取动力学。这些分析是在非洲爪蟾卵提取物体外重建的细胞核上进行的,这些细胞核既提供了核蛋白导入所涉及的完整生化因子,也能畅通无阻地进入核孔。我们发现DNA的吸收不依赖于ATP或GTP水解,但被小麦胚芽凝集素阻断。动力学比从流体动力学的考虑中所预期的要慢得多。将数据拟合到一个简单的模型表明飞牛顿力和与吸收过程相关的大摩擦。
描述了一种用直写光刻技术创建微尺度图案表面的方法。紧聚焦,低功率红外激光束应用于含有可溶性试剂的均匀前驱体溶液。当激光直接聚焦在玻璃-溶液界面上时,它开始局部沉淀牢固地附着在基板上的固体产物。操作激光瞬间形成孤立的光斑,而移动显微镜台或激光光斑则画出连续的线。该方法已被证明为金属银和金,氧化铜,二硫化钼,提出了广泛的合适材料范围。用化学反应进一步修饰银图案。它们的形态和物理性质可以在沉积过程中通过盖覆剂的使用而改变,这可能为进一步的功能化提供开端。
细胞运动接触抑制的分子基础仍然很大程度上是未知的。钙粘蛋白是介导细胞-细胞粘附的主要受体,在细胞质中与犰狳家族蛋白相关,包括β -和γ -连环蛋白和p120连环蛋白(p120ctn), e -钙粘蛋白介导的接触形成被证明可以抑制细胞运动。我们研究p120ctn是否可能在这一调控中发挥作用。我们在此发现,p120ctn在成纤维细胞和上皮细胞中的过表达导致细胞形状、运动性和与细胞外基质的粘附性发生显著变化。p120ctn转染的细胞表现出增加的丝状/片状活动,收缩性和局灶性粘连形成的减少,以及增强的迁移能力。p120ctn的这些作用是由Rho家族的小GTPases介导的。与未转染的对照细胞相比,p120ctn表达水平高5倍的细胞中这些GTPases的活性的直接评估显示Cdc42和Rac活性的显著增强。此外,p120ctn与显性阴性Cdc42和Rac共转染,或组成型活性Rho,抑制了p120ctn的形态效应。共聚焦免疫荧光显示内源性p120ctn在密集培养中的分布表明,钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触的形成伴随着p120ctn隔离到连接区域。在稀疏培养中,p120ctn分布在细胞质中。与过量的E-cadherin共转染导致外源性p120ctn隔离到细胞-细胞连接或含有cadherin的小泡中,并消除p120ctn对细胞形态的影响。 Thus, p120ctn may couple the formation and disruption of cadherin-mediated contacts with regulation of cell motility by triggering pathway(s) affecting Rho family GTPases.
2000
我们发现,在一个活的真核细胞内,被吞噬的微球的均方位移在短时间内表现为增强的扩散缩放t(3/2),在较长时间内明显交叉到次扩散或普通扩散缩放。在细胞核附近观察到的运动是由于与微管相关运动蛋白的相互作用,而不是热布朗运动。我们提出,细胞内聚合物网络引入的时间依赖性摩擦导致亚弹道运动,类似于在半柔性生物聚合物的被动网络中观察到的亚扩散。
x连锁基因双皮质蛋白(DCX)的突变导致男性无脑畸形或女性皮层下层流异位(“双皮质”),发现了各种类型的突变,序列差异包括整个基因的无义突变、剪接位点突变和错义突变。最近,我们和其他人证明了DCX相互作用并稳定微管。在这里,我们对来自各种生物的DCX和DCX样蛋白进行了详细的序列分析,并定义了一个进化保守的Doublecortin (DC)结构域。该结构域通常出现在蛋白质的n端,由两个串联重复的80个氨基酸区域组成。在绝大多数患者中,DCX的错义突变落在保守区域内。我们在体外和体内表达了DCX或DCLK (KIAA0369)重复序列。我们的结果表明,第一个重复结合微管蛋白,而不是微管,并促进微管聚合。为了研究DCX突变的功能后果,我们在COS7细胞中过表达了7个报道的突变,并检查了它们对微管细胞骨架的影响。结果表明,一些突变破坏了微管。最严重的影响是在氨基酸125 (Y125H)处酪氨酸到组氨酸突变。作为一种重组蛋白,这种突变在体外高摩尔浓度下破坏微管。根据进化定义的DC-repeat基序,讨论了不同突变的位置。 The results from this study emphasize the importance of DCX-microtubule interaction during normal and abnormal brain development.
Tyrphostin AG-1714和几个具有硝基苯丙二腈(BMN)一般结构的相关分子破坏了大量培养细胞中的微管。这一过程可以通过紫杉醇稳定微管或用pervanadate预处理细胞来抑制,从而抑制酪氨酸磷酸酶并增加细胞中磷酸酪氨酸的总体水平。与其他微管干扰药物如诺可达唑或秋水仙碱不同,斑疹毒素AG-1714在体外不干扰微管聚合或稳定性,这表明这种斑疹毒素对微管的影响是间接的。这些结果暗示蛋白酪氨酸磷酸化参与调控整体微管动力学。AG-1714型斑尾蛋白可能是识别这种微管调控途径的有力工具。(C) 2000年Wiley-Liss公司
神经调节蛋白可以通过激活来自ErbB家族的受体在体内和培养中触发细胞的形态发生信号。我们在缺乏内源性erbb -蛋白的32D髓系细胞和仅表达ErbB-2的CHO细胞中表达了各种erbb -受体。我们在这里发现,ErbB-3/ErbB-2异二聚体受体的激活触发pi3激酶依赖性的薄片足的形成和扩散,而单个erbb受体同型二聚体以及ErbB-3/ErbB-1异二聚体的效果要差得多。表达ErB3/ErbB-2的CHO细胞与粘附受体N-cadherin一起形成上皮样菌落。神经调节蛋白激活细胞运动,导致这些集植体转变为环状多细胞阵列,类似于神经调节蛋白在不同类型上皮细胞中的诱导(Chausovsky et al., 1998)。这一过程需要pi3激酶和MAP激酶的活性,并依赖于肌动蛋白和微管为基础的细胞骨架的协调变化。ErbB-2的转激活不足以激活细胞活力和环的形成,ErbB-3的c端结构域承载PI3-kinase的p85亚基的对接位点对这些形态发生作用至关重要。因此,ErbB-3与ErbB-2结合,通过其c端结构域介导细胞骨架和粘附改变,激活细胞扩散和运动,导致复杂结构的形成,如多细胞环。
通过扫描力显微镜(SFM)获得的无序膜蛋白结构的横向分辨率往往是有限的。我们已经成像了一个这样的结构——核孔复合体,从非洲爪蟾卵母细胞中分离出的化学固定核包膜,优化程序以最大限度地提高横向分辨率。这些图像在空气中使用声波敲击获得,揭示了npc相关的核质和细胞质特征,分辨率接近场发射透镜内扫描电子显微镜。迄今为止,一些特征一直没有被SFM探测到。我们还证明了相位成像的有用性,并表明,扫描参数设置适当,对比度是由表面形貌。所获得的结果证实并证实了先前的EM和SFM数据,并说明了化学固定和振荡力显微镜在高空间分辨率下成像大型无序膜蛋白结构的适用性。
1999
已知Caldesmon以Ca2+-钙调素调节的方式抑制肌动球蛋白的atp酶活性。尽管caldesmon的一种非肌肉亚型被广泛表达,但其功能作用尚未阐明。我们研究了非肌肉钙质对成纤维细胞收缩力、肌动蛋白细胞骨架组织和局灶性粘连形成的影响。瞬时转染非肌肉胼胝可阻止肌球蛋白ii依赖的细胞收缩能力,并诱导酪氨酸磷酸化的局灶性粘连的数量和大小减少。caldesmon的表达干扰Rho a - v14介导的局灶性粘连和应力纤维的形成,以及微管破坏诱导的局灶性粘连的形成。这种抑制作用取决于胼胝体的肌动蛋白和肌球蛋白结合区域,因为缺少这两个区域的截断变体是不活跃的。caldesmon的作用被离子团A23187、thapsigargin和膜去极化阻断,可能是因为Ca2+-calmodulin或Ca2+-S100蛋白能够拮抗caldesmon对肌动球蛋白收缩的抑制功能。这些结果表明非肌肉胼胝体在肌动球蛋白收缩性和粘连依赖信号的生理调节中起作用,并进一步证明收缩性参与了局灶性粘连的形成。
x连锁无脑畸形是一种影响男性的严重脑部畸形。最近已经证明双皮质蛋白基因与这种疾病有关。为了研究Doublecortin的功能,我们对转染COS细胞后的蛋白进行了分析。体外实验(使用生化方法,DIC显微镜和电子显微镜)表明,Doublecortin直接结合微管,稳定微管并引起捆扎。体内实验也表明,Doublecortin能够稳定微管并引起捆扎。双皮质蛋白(Doublecortin)是一种等电点为10的碱性蛋白,是典型的微管结合蛋白。然而,其序列不包含已知的微管结合域。本研究中使用Doublecortin和我们之前对另一种无脑畸形基因(LIS1)的研究结果强调了在神经元形态发生过程中调节微管动力学和稳定性的核心作用。
1998
通过直接观察单个聚合物中单个点的运动,研究了聚合物网络的动力学。以相当刚性的生物微管为例,我们将系统的空间和雾凇尺度扩展到那些可访问的光学显微镜和标准视频工具。跟踪是通过化学攻击光学解决的微球到灯丝上的一个点来实现的。我们研究这一点的时间动力学,没有空间平均固有的散射方法。结果表明,单点的均方位移对局部纤维和网络性质敏感。[s0031 - 9007(97) 05158 - 2]。
1997
人脑结构的形成涉及广泛的神经元迁移,这一过程依赖于细胞骨架重排列。在发育性脑畸形无脑畸形患者中,神经元迁移被认为是中断的。先前的研究表明,在无脑畸形患者中发现的缺陷基因LIS1是血小板激活因子乙酰水解酶的一个亚基。我们通过免疫染色和共组装检测了LIS1与微管的相互作用,通过共免疫沉淀和表面等离子体共振变化分析了LIS1与微管的相互作用。体外微管动力学测量表明,生理浓度的LIS1确实减少了微管突变事件。从而导致微管最大长度的净增加。此外,通过定量Western blots测量,大脑中的LIS1蛋白浓度很高,约为脑微管蛋白浓度的五分之一。我们的新发现表明,LIS1是一种显示多种细胞相互作用的蛋白质,与细胞骨架的相互作用可能被证明是转导血小板激活因子产生的信号的模式。我们假设LIS1-细胞骨架的相互作用对神经元迁移很重要。无脑畸形患者有缺陷的过程。