出版物

原核生物利用多顺子信息(操纵子)共同翻译参与相同生物过程的蛋白质。真核生物是否通过选择性地组装和翻译来自不同染色体的单顺子信息来实现类似的调控尚不清楚。我们利用转录特异性RNA下拉和RNA-seq/RT-PCR鉴定了共沉淀为核糖核蛋白(RNP)复合物的酵母mrna。与真核RNA操纵子的假设一致，编码交配途径组分、热休克蛋白和线粒体外膜蛋白的mrna在反式中重复，形成离散的信使核糖核蛋白(mRNP)复合体(称为超子)。染色质捕获和等位基因标记实验表明，编码多重mrna的基因在物理上相互作用;因此，RNA组装可能是共同调控基因表达的结果。Transperon的组装和功能依赖于组蛋白H4，其缺失导致RNA多路复用缺陷，信息素反应性和交配降低，热休克敏感性增加。我们认为基因间关联和非典型组蛋白H4功能有助于真核细胞中跨子的形成并调节细胞生理学。

在真核细胞中，一小部分mRNA分子可以从一个细胞转移到另一个细胞。mRNA的传递主要通过膜纳米管进行，膜纳米管是由多种细胞类型产生的细长突起，可以连接相距数百微米的细胞。潜在地，mrna也可能通过细胞外囊泡(EVs)转移。在这里，我们描述了一种检测两种不同细胞类型共培养中转移mRNA的方法，并区分纳米管和ev介导的转移。该方法使用单分子荧光原位杂交(smFISH)技术对转移的mRNA分子及其亚细胞定位进行准确定量检测。遵循这里提出的指导方针将允许用户在任何共培养系统中研究大多数转录本的mRNA转移。此外，我们还提出了改进smFISH过程中纳米管保存的方法。

转录和RNA衰变在基因表达过程中起着至关重要的作用，准确测量细胞mRNA水平的能力对于理解这一调控至关重要。在这里，我们描述了一种单分子荧光原位杂交(smFISH)方法(如Haimovich等人，2017)，检测单个细胞中的单个RNA分子。该技术采用多个单链、荧光标记的短DNA探针，杂交固定细胞中的目标rna，允许在单细胞水平和单分子分辨率上定量和定位细胞质和核rna。分析smFISH数据提供了细胞质(“成熟”)mrna数量的绝对定量数据，不同转录位点上新生RNA分子的数量，以及这些RNA在细胞质和/或核质中的空间定位。

rna已被证明在哺乳动物细胞之间进行转移，尽管这一现象背后的机制及其对细胞生理学的整体重要性尚不清楚。许多出版物表明，rna (microRNAs和不完整mrna)通过细胞外囊泡(例如，外泌体)进行转移。然而，与基于扩散的转移机制相反，我们发现全长mrna通过连接供体和受体细胞的膜纳米管(mNTs)的细胞质延伸进行直接细胞-细胞转移。通过使用简单的共培养实验模型和单分子成像，我们提供了定量数据，显示mrna在接触的细胞之间转移。进行转移的mrna的例子包括编码GFP、小鼠β -肌动蛋白、人类周期蛋白D1、BRCA1、MT2A和HER2的mrna。我们发现，在所有测试的共培养模型中都发生了细胞间mRNA转移(例如，原代细胞之间，永生化细胞之间，以及在永生化人类和小鼠细胞的共培养中)。快速的mRNA转移依赖于肌动蛋白，但不依赖于从头合成的蛋白质，并受应激条件和基因表达水平的调节。因此，这项工作支持了这样一个假设，即全长mrna通过精细的结构连接在细胞之间进行转移。重要的是，与miRNA或RNA片段的传递不同，这种通信过程传递的遗传信息可能潜在地改变受体细胞蛋白质组。这一现象可能被证明对组织的正常发育和功能以及宿主-寄生虫或共生相互作用很重要。

mrna和蛋白质之间的相互作用在细胞形态和生理调控中起着至关重要的作用，最近的研究表明，许多蛋白质除了以前的特征作用外，还可以作为RNA结合蛋白(RBPs)。通过使用酵母作为生物模型，我们用MS2适体标记了感兴趣的内源性表达mrna，然后进行生化下拉和质谱分析，以揭示在特定mrna运输中充当rbp的已知蛋白质的身份。在这里，我们介绍了酵母中细胞生理功能所必需的两个新型RBPs的例子。首先，我们发现COPI囊泡外套复合物对于编码线粒体蛋白(mMPs)的mrna定位到线粒体和线粒体功能是必要的。任何一种COPI蛋白的失活都会导致mMP与COPI本身的结合减少，从而导致mMP与线粒体的分离，线粒体膜电位降低，体内和体外蛋白质输入减少，以及线粒体呼吸的严重缺陷。使用模型mMP (OXA1)，我们观察到COPI失活(或潜在COPI相互作用位点的突变)导致mRNA定位改变和细胞呼吸受损(Zabezhinsky等人，Cell Rep(2016) 15:540‐549)。其次，我们发现组蛋白4 (Hhf1)是一种与STE2 mRNA结合的蛋白质，它编码α因子受体，并参与细胞间的交配。删除组蛋白4的两个平行碱基中的任何一个都会导致交配效率降低两倍，而删除两个特定的组蛋白乙酰转移酶也会产生相同的效果。通过将CRISPR/Cas9系统应用于酵母，我们成功地突变了HHF1的内源性乙酰化位点，并看到了交配效率的显著降低。此外，Hhf1乙酰化位点的突变显示与STE2 mRNA的结合减少。总之，我们的方法表明，内源性mRNA标记随后的下拉和结合蛋白的分析可以导致对已知蛋白质功能的惊人新见解。

蛋白质在细胞内的定位可以通过mRNA的靶向和本地化翻译来实现。然而，我们对mRNA靶向和蛋白质定位的动态以及这种现象有多普遍的理解尚不清楚。基于质粒的表达系统已被用于可视化外源表达的mrna和蛋白质;然而，这些方法通常在大于内源性的水平上产生它们，并可能导致错误定位。因此，需要一种同时可视化活细胞中内源性mrna及其翻译产物的方法。我们之前开发了一种方法(m-TAG)，通过在任何基因的开放阅读框(ORF)和3' UTR之间插入MS2适体序列来定位酵母中内源性表达的mrna。在与GFP融合的MS2 rna结合外套蛋白(MS2- cp)共表达后，使用荧光显微镜定位带有3' utr的适体标记mrna。在这里，我们描述了一种先进的方法(mp-TAG)，首次允许在活酵母中同时显示内源性表达的mrna及其翻译产物。同源重组用于将mCherry基因和MS2-CP结合位点插入任何ORF下游，以分别定位蛋白质和mRNA。为了证明这一概念，我们将ATP2标记为一个代表基因，并证明内源性ATP2 mRNA和蛋白质定位于线粒体，如前所述。 In addition, we demonstrate that tagged proteins like Hhf2, Vph1, and Yef3 localize to their expected subcellular location, while the localization of their mRNAs is revealed for the first time.

细胞内mRNA靶向和定位翻译是蛋白质定位的潜在决定因素。为了促进靶向，mrna具有特定的顺式作用序列基序，可被反式作用rna结合蛋白(RBPs)识别。虽然许多mrna被贩卖，但我们对涉及的rbp以及这些核糖核蛋白(RNP)复合物中存在的额外转录本的了解有限。为了便于识别与特定mrna结合的rbp和转录本，我们开发了rna结合蛋白纯化和鉴定(RaPID)，这是一种新技术，允许MS2适体标记mrna的亲和纯化，随后分别使用质谱法和RT-PCR检测结合的rbp和转录本。RaPID从酵母和哺乳动物细胞中有效分离出特定的mrna，并鉴定出已知的mRNA-RBP相互作用(例如ASH1-She2;beta-Actin-IMP1)。通过快速分离标记的OXA1 mRNA，我们可以识别出酵母COPI亚基(即Sec27)作为候选相互作用蛋白。这一发现被观察到在限制性温度下，部分OXA1 mRNA在sec27-1温度敏感突变体中脱位。最后，RaPID还首次用于显示同一RNP复合体中不同RNA物种的生物化学共存(例如，酵母SRO7、WSC2、SEC3和IST2 mRNA与ASH1 mRNA的共沉淀)。

在真核生物中，细胞极性是细胞分裂、形态发生和运动所必需的，是由细胞骨架和分泌途径的动态控制来决定的，以促进定向生长。在酵母菌中，有三个必需的和严格调控的过程来协调极化和促进芽的生长。这些过程包括磷酸肌醇(PI)信号，Rho GTPase调节肌动蛋白细胞骨架和胞吐。到目前为止，这些不同过程之间的相互作用尚不清楚，已经提出了两种主要模型(空间标记和变构局部激活)用于Rho GTPase控制酵母中的极化。在这里，我们总结了这些生长过程之间的相互关系，并提出了一个更统一的模型，即胞吐信号模型，该模型提出胞吐和肌动蛋白调节是由PI信号介导的完全集成事件。

Ddi1/Vsm1是一种泛素受体，参与调节酿酒酵母的细胞周期和晚期分泌途径。Ddi1具有三个结构域:NH(2)末端泛素样结构域(UBL)、cooh末端泛素相关结构域(UBA)和逆转录病毒天冬氨酸蛋白酶结构域(RVP)。在这里，我们演示了涉及同型二聚化、检查点调节、定位和t-SNARE结合的结构域。RVP结构域是蛋白同二聚化所必需的，而UBL和UBA结构域是拯救pds1-128检查点突变体和在细胞核中富集GFP-Ddi1所必需的。天门冬氨酸-220的突变取消了对pds1-128细胞的拯救，但对同型二聚体没有影响。天门冬氨酸-220是推测的天门冬氨酸蛋白酶功能所必需的。因此，Ddi1的催化活性可能是检查点调控所必需的。Sso1 t- snare相互作用结构域映射到残基344-395，并在苏氨酸T346和T348上磷酸化。T348是Sso结合所必需的，磷酸化对功能很重要，因为减少磷酸化的突变(例如，Ddi1(T346A)， Ddi1(T348A))不能促进sec9-4 t-SNARE突变体的生长。相反，可磷酸化形式的Ddi1的过度生产(例如，Ddi1, Ddi1(S341A))挽救sec9-4细胞的生长，类似于Sso1的过度生产。因此，Ddi1通过其不同的结构域参与多个细胞过程，磷酸化可能调节胞外功能。

出芽酵母酿酒酵母的极化生长依赖于出芽前细胞膜上极性和分泌因子的不对称定位和富集。我们研究了这些因子(即Cdc42、Sec4和Sro7)是如何到达芽点的，发现它们各自的mrna在核分裂之前定位于萌芽的尖端。不对称mRNA定位取决于促进ASH1 mRNA定位的因素(例如，3'未翻译区，She蛋白1至5,Puffi，肌动蛋白细胞骨架，以及与She2的物理联系)。mRNA的放置先于蛋白质的富集和随后的芽的出现，这意味着mRNA的定位有助于极化。相应的，编码非对称分布蛋白质的mrna(如Snc1, Mso1, Tub1, Pex3和Oxa1)是不极化的。最后，影响皮层内质网(ER)进入和在芽中锚定的突变(myo4 Delta, sec3 Delta和srp101)也影响不对称的mRNA定位。芽定位mrna，包括ASH1，被发现以She2和sec3依赖的方式与ER微粒体共分;因此，不对称mRNA转运和皮质ER遗传在酵母中是相互关联的过程。

逆转录病毒的天冬氨酸蛋白酶是同型二聚体，而真核生物的天冬氨酸蛋白酶往往是大的、具有2倍内部对称性的单体酶。有人提出，当代的单体天冬氨酸蛋白酶是由原始同源二聚酶的基因复制和融合进化而来的。最近的序列分析表明，这种“化石”二聚天冬氨酸蛋白酶仍然编码在真核生物基因组中。我们提出了真核生物中保留二聚天冬氨酸蛋白酶的证据。酿酒酵母蛋白Ddi1的一个结构域的x射线晶体结构表明，它是一个具有类似于逆转录病毒蛋白酶折叠的二聚体。此外，在HIV蛋白酶活性位点上的双Asp-Thr-Gly-Ala氨基酸序列motif在Ddi1结构中被发现具有相同的几何结构。然而，假定的底物结合槽在Ddi1中比在逆转录病毒蛋白酶中更宽，这表明Ddi1可以容纳更笨重的底物。Ddi1属于泛素受体蛋白质家族，它们具有结合泛素化底物和蛋白酶体的共同能力。泛素受体包含一个氨基端泛素样(UBL)结构域和一个羧基端泛素相关(UBA)结构域，但Ddi1是唯一一个UBL和UBA结构域位于天冬氨酸蛋白酶样结构域旁边的代表性受体。Ddi1的中心结构域与逆转录病毒蛋白酶之间的显著结构相似性，在全局折叠和活性位点细节上，表明Ddi1在细胞中调节蛋白质周转过程中起蛋白水解作用。 (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

酵母胞外SNARE复合物由Sso1/ 2靶SNAREs、Snc1/2泡状SNAREs和Sec9靶SNARE各一个分子组成，它们形成了在进化中保守的融合复合物。另一种蛋白质Sec1与SNARE复合物结合以促进组装。我们发现，Sec1相互作用蛋白Mso1也与SNARE复合物结合，并在介导Sec1功能中发挥作用。与Sec1一样，Mso1在含有SNARE复合物的细胞(即野生型、Sec1 -1和sec18-1细胞)中与SNAREs结合，但在复合物形成受到抑制的细胞(即sec4-8细胞)中不与SNAREs结合。然而，即使在sec4-8细胞中，Mso1仍然与Sec1相关，这表明它们是一对。当SNARE复合物的形成未受到损害时，Mso1主要定位于芽的质膜，而当组装被阻止时，Mso1主要定位于细胞质。遗传研究表明，Mso1增强Sec1功能，同时削弱Sec4 GTPase功能。这种双重作用可能在Sec4关闭和sec1介导的SNARE组装之间传递时间调控。值得注意的是，在哺乳动物Munc13/Mint蛋白中，Mso1的C端有一个小区域是保守的，对于适当的膜定位是必要的。过度表达缺乏该结构域的Mso1 (Mso1-(1-193))抑制了含有衰减的Sec4 GTPase的细胞的生长。 These results suggest that Mso1 is a component of the exocytic SNARE complex and a possible ortholog of the Munc13/Mint proteins.

酵母中分泌囊泡的传递和mRNA到芽的不对称分布都依赖于肌动蛋白的细胞骨架。在这里，我们检查了外胞器的成分是否在mRNA转运中起作用。通过在原位和体内筛选分泌突变体，我们发现所有的ASH1 mRNA定位模式都发生了改变。这些包括CDC42和RHO3的等位基因(CDC42 -6和RHO3 - v51)被认为专门调节分泌囊泡的融合，但也被发现强烈影响细胞骨架。最有趣的是，不直接参与肌动蛋白调节的晚期分泌相关基因的突变也显示了ASH1 mRNA分布的实质性改变。这些突变包括编码外囊成分的基因(SEC10和SEC15)、SNARE调节蛋白(SEC1、SEC4和SRO7)、SNAREs (SEC9和SSO1/2)以及高尔基输出蛋白(PIK1和YPT31/32)的突变。重要的是，在所有这些菌株中都观察到肌动蛋白细胞骨架的显著缺陷，因此暗示了肌动蛋白的放松和mRNA转运抑制之间的已知因果关系。我们的新观察表明，囊泡运输调节酵母中的肌动蛋白细胞骨架(而不是相反)，导致随后的mRNA运输和定位缺陷。

SNAREs(可溶性n -乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白附着蛋白受体)是参与真核细胞内膜融合的膜相关蛋白。SNAREs由三个不同且保守的分子家族组成，它们直接作为膜融合因子，或至少作为使膜接近并允许后续融合事件发生的元素。虽然导致融合的分子事件仍在争论中，但很明显，需要一些额外的因素才能在体内实现snare -介导的膜融合。这些因子可以统称为SNARE调控因子(如Sec1/Munc18、synaptotagmin、GATE-16、LMA1、Munc13/UNC-13、synaptophysin、tomosyn、Vsm1等)，它们直接与SNARE结合，参与SNARE组装的调控以及SNAREs参与转运事件的能力。此外，最近的研究表明，翻译后修饰(如磷酸化)在SNARE功能的调节中发挥作用。在这篇综述中，将讨论SNARE调控因子在SNARE组装中的可能作用以及SNARE磷酸化在细胞膜转运调控中的参与。(C) 2003 Elsevier B.V.版权所有。

OS-9基因映射到12号染色体的一个区域(q13-15)，该区域在人骨肉瘤中被高度扩增，编码一种功能未知的蛋白质。在这里，我们从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中鉴定了一个同源物YOS9 (YDR057w)。酵母蛋白(Yos9)是一种定位于内质网(ER)的膜相关糖蛋白。YOS9与er -高尔基体转运相关基因相互作用，特别是SEC34，其温度敏感突变体被YOS9过表达拯救。有趣的是，Yos9似乎在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白到高尔基体的运输中发挥直接作用。Yos9直接与Gas1和Mkc7结合，并在过表达Yos9的细胞中加速Gas1的运输和处理。相应地，在YOS9缺失的细胞中，Gas1的处理速度减慢。在缺乏或过度表达Yos9的细胞中，未检测到对非gpi锚定蛋白(如转化酶和羧肽酶Y)的运输和加工的影响。由于Yos9不是Emp24复合物的组成部分，它可能在酵母和哺乳动物的er -高尔基体运输中作为gpi锚定蛋白的新型护送因子。

我们筛选了酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)晚期分泌途径v-SNAREs相互作用的蛋白质。一种新的蛋白质，命名为Vsm1，在双杂交系统中与Snc2 v-SNARE紧密结合，可以与可溶性酵母细胞提取物中的Snc1或Snc2共免疫沉淀。VSM1基因的破坏导致分泌到培养基中的蛋白质增加，但不影响转化酶的加工或分泌。相反，在Sec9 t-SNARE温度敏感突变的细胞(Sec9 -4细胞)中，VSM1过表达导致不含转化酶的低密度分泌囊泡的积累，抑制细胞生长和蛋白质分泌到培养基中，并阻止SNC1过表达对温度敏感表型的拯救。然而，VSM1过表达并不影响含有sec9-7等位基因的酵母，与sec9-4相反，该等位基因编码t-SNARE蛋白，能够在体外限制性温度下形成稳定的SNARE复合物。在这些结果的基础上，我们提出Vsm1是一种新型的v- snare相互作用蛋白，似乎是构成性胞吐的负调控因子，而且这种调控似乎特异性于酵母细胞中两条平行的胞吐通路中的一条。

v-SNARE的synaptobrevin/VAMP家族成员被认为是低等和高等真核生物中囊泡停靠和胞吐的关键。在这里，我们描述了酵母突变体，它们似乎在分泌中绕过了已知的v-SNARE要求。编码相关er定位膜蛋白的VBM1或VBM2的隐性突变，允许酵母在缺乏Snc v-SNAREs的情况下正常生长和分泌。这些突变体在蛋白质运输中表现出选择性改变，导致某些蛋白质货物的差异运输和分泌。然而，液泡标记物羧基肽酶Y和分泌蛋白转化酶的处理在这些突变体中表现正常，表明该途径早期的一般蛋白质运输不受影响。有趣的是，VBM1和VBM2是ELO3和ELO2的等位基因，两个基因tl-lat最近已被证明介导超长链脂肪酸的延伸和随后神经酰胺和肌醇鞘脂的合成。因此，在构成性胞吐中的v-SNARE需求被分泌途径的早期成分的突变所废除，这些成分在脂质合成水平上起作用，影响分泌囊泡分类和运送蛋白质货物的能力。

我们正在研究囊泡相关膜蛋白的synaptobrevin/VAMP家族的酵母同源物，它在具有刺激偶联分泌能力的细胞以及其他类型的细胞中充当囊泡室可溶性n -乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(v-SNAREs)。酵母同源物Snc1和Snc2定位于分泌囊泡，是酿酒酵母正常大量分泌所必需的。在这里，我们使用Snc缺失突变体和嵌合Snc- vamp蛋白来证明这些v-SNAREs可以被解剖成在体内对胞外功能不可或缺或可有可无的区域。我们发现了一个包含两个预测的两亲性α -螺旋(螺旋1和螺旋2)(残基32-85)的区域，这被认为是形成螺旋螺旋结构的区域，对于赋予酵母胞吐作用至关重要。螺旋1或螺旋2片段的缺失导致该蛋白完全丧失向snc细胞授予分泌能力的能力，并与所提出的融合复合物的组成部分(Sec9和Sso2 t-SNAREs以及Sec17 α - snap同源物)相互作用的遗传能力。相反，在可变区域(残基2-27)或假定的泡内区域(残基115-117)的缺失对v-SNARE功能没有有害影响。这使得氨基端或羧基端的序列不太可能以胞外能力起作用。随着更多利用嵌合Snc-VAMP蛋白的研究，我们认为，尽管Snc和synaptobrevin/VAMP蛋白已经进化到介导有很大不同的胞外程序，但它们的结构要求和作用在进化中仍然非常保守。

酵母腺苷酸环化酶相关蛋白(CAP)被鉴定为ras活化环化酶复合物的组成部分。CAP由两个功能域组成，由一个富含脯氨酸的区域分开。一个结构域位于氨基端，通过腺苷环化酶介导RAS信号，而一个结构域位于羧基端，参与调节细胞生长和形态发生。最近，酵母CAP的羧基端被证明具有隔离肌动蛋白的功能，但这一功能是否保守，是否是该结构域的唯一功能，尚不清楚。在这里，我们证明了CAP和CAP同源物的羧基端结构域具有两个独立的功能，我们表明酵母CAP和哺乳动物CAP同源物MCH1的羧基端都与肌动蛋白结合，我们还表明该结构域包含一个二聚化信号，允许CAP和MCH1形成同型二聚体和异型二聚体。肌动蛋白结合和二聚体的性质是由羧基末端的不同区域介导的;最后，我们提出的证据表明，CAP富含脯氨酸区域的一段与它在酵母中的定位有关。总之，这些结果表明，CAP蛋白质的所有三个结构域都有功能。