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氨基酸在种子的中枢代谢中起着至关重要的作用。它们主要用于合成种子储存蛋白质，但也可作为次生代谢产物生物合成的前体和能量来源。在这里，我们旨在描述近年来积累的关于种子发育过程中游离氨基酸(FAAs)含量变化的知识。由于几种必需氨基酸在种子中含量较低(如Lys、Met、Thr、Val、Leu、Ile和His)，或在种子发育中发挥独特的功能作用(如Pro和非蛋白源性γ-氨基丁酸[GABA])，我们还简要描述了为了改变它们在种子中的含量并确定操作对种子生物学的影响而进行的研究。这些研究的大部分都强调了FAAs生物合成途径之间的强正相关性，这意味着当种子中某种氨基酸的水平发生变化时，其他FAAs的含量也趋于升高。这些观察结果推断，在种子发育过程中FAAs的生物合成中存在一个紧密的调控网络。

苯丙氨酸(Phe)是一大类植物特化代谢物的前体，包括芳香的挥发性苯-苯丙素(BPs)。在植物中，产生苯丙氨酸的主要途径是通过砷酸盐，而通过苯丙酮酸(PPY)的途径被认为只是一种替代途径。与植物不同，在大多数微生物中，导致苯丙氨酸合成的唯一途径是通过聚吡啶。在这里，我们研究了矮牵牛中PPY产量增加对花和叶中BPs挥发物和其他源自Phe的特化代谢产物形成的影响。通过PPY途径的刺激是通过将矮牵牛转化为PheA *来实现的，PheA *是一种编码细菌反馈不敏感双功能chorisate mutase/prephenate脱水酶的基因。PheA *过表达导致花BP挥发物如苯乙醛、苯甲醛、乙酸苄酯、香草素和丁香酚水平急剧增加。矮牵牛花特有的三种BP通路均在矮牵牛花*中受到刺激。相反，过表达PheA *对叶片和花中氨基酸和非挥发性代谢物的含量影响不大。唯一的例外是迷迭香酸酯水平的急剧增加，迷迭香酸酯是苯乙烯基咖啡酸酯和苯乙烯基3,4-二羟基苯乙酸酯之间的缀合物。*矮牵牛花可作为揭示聚吡啶在bp生成中的作用的极好系统，包括将聚吡啶直接转化为芳香挥发物的可能途径。 This study emphasizes the potential of the PPY route in achieving fragrance enhancement in flowering plants.

赖氨酸被认为是预防营养不良和严重疾病所需的“必需氨基酸”，特别是在发展中国家。它主要从各种植物性食物中获得。在本期(第4285-4296页)中，Yang及其同事报告了在转基因水稻植株中成功刺激赖氨酸生物合成并抑制其分解代谢而不改变植物表型。这种方法导致了高赖氨酸水稻的生产，使其成为营养良好的作物。

虽然氨基酸对所有形式的生命都至关重要，但只有人类和动物不能从头合成、因此必须从饮食中获取的蛋白质原氨基酸才被列为必需氨基酸。九种氨基酸——赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和组氨酸——符合这一定义。尽管这些氨基酸具有重要的营养价值，但其中一些氨基酸在世界上许多主要作物中数量有限。近年来，反向遗传学和生化方法的结合已被用于定义编码负责合成、降解和调节这些氨基酸的酶的基因。在这篇综述中，我们描述了我们对必需氨基酸代谢的最新进展，讨论了提高其在植物中的水平的方法，并评价了在作物植物中对其生物强化的努力。

环境压力，如高光强和温度，会诱导莽草酸通路、芳香族氨基酸(AAA)通路和AAAs下游通路。诱导导致产生特殊的代谢物，保护细胞免受氧化损伤。不同的AAA衍生通路的调控仍然没有很好地理解。为了深入了解这一调控，我们增加了红葡萄的AAA产量。Gamay红细胞悬浮液，不诱导细胞的外部应激，并表征了这种诱导的代谢作用。通过在组成启动子下表达莽草酸途径的3-脱氧-d -阿拉伯七聚酸7-磷酸合成酶(AroG*)的反馈不敏感细菌形式，增加了AAA的产量。AroG*蛋白的存在导致莽草酸和AAA途径的初级代谢物水平升高，包括苯丙氨酸和酪氨酸，并导致苯丙类化合物急剧增加。AroG*转化的品系积累的白藜芦醇和二氢槲皮素水平分别提高了20倍和150倍。槲皮素由二氢槲皮素和白藜芦醇组成，是由环境压力诱导的促进健康的代谢物。沿着二苯乙烯类、苯类和苯丙类途径检测关键基因的表达水平表明，转录不受AroG*的影响。 This suggests that concentrations of AAAs, and of phenylalanine in particular, are rate-limiting in production of these metabolites. In contrast, increased phenylalanine production did not lead to elevated concentrations of anthocyanins, even though they are also phenylpropanoid metabolites. This suggests a control mechanism of this pathway that is independent of AAA concentration. Interestingly, total anthocyanin concentrations were slightly lower in AroG* cells, and the relative frequencies of the different anthocyanins changed as well.

种子是被子植物进化维持的主要器官。在种子萌发的初始阶段，种子积累了大量的储存化合物作为营养物质和能量储备。储存化合物的积累需要大量的能量，由于氧气和光线的渗透减少，特别是进入种子内部，能量的产生可能受到限制。在这篇综述中，我们讨论了由于氧气渗透到种子组织的次优渗透而导致的有限能量生产的种子代谢的调整。我们还讨论了光合作用在种子发育过程中的作用及其对发育中的种子能量状态的贡献。最后，我们描述了氨基酸代谢对种子能量状态的贡献，重点介绍了导致Lys、Thr、Met和Ile合成和分解代谢的asp家族途径。

巨自噬(以下简称自噬)是一种细胞机制，致力于将不必要的细胞质成分降解和循环利用，将它们转移到细胞的溶腔区(植物中的液泡)。自噬通常是由引起能量剥夺的压力引起的，其操作发生在特殊的囊泡中，称为自噬体。自噬也以选择性的方式运作，回收特定的成分，如细胞器，蛋白质聚集物甚至特定的蛋白质，选择性自噬与细胞的家务管理和应激反应有关。在植物中，选择性自噬最近被证明可以降解线粒体、质体和过氧化物酶体，或细胞器成分，如内质网(ER)膜和叶绿体衍生的蛋白质，如Rubisco。这种能力将选择性自噬作为细胞稳态维持的主要因素，无论是在压力下还是在有利的环境条件下。在这里，我们回顾了最近在植物细胞过程中的进展，并进一步讨论了它对植物生理学的影响。

人类和家畜一样，不能合成一些对它们生存至关重要的必需氨基酸。因此，这些生物必须从它们的饮食中获得这些必需的氨基酸。谷物和豆类作物是全世界人类和牲畜的主要食物和饲料来源，其中一些必需氨基酸的含量有限，特别是赖氨酸和蛋氨酸。人们通过传统育种和诱变技术，在作物植物中强化这些必需氨基酸。然而，除了在玉米上获得了一些结果外，这些方法都不成功。因此，使用基因工程方法的额外努力集中在增加这些必需氨基酸的合成和减少分解代谢，以及在这些氨基酸中富集的重组蛋白的表达上。在本综述中，我们讨论了与植物中这些氨基酸的合成和积累相关的基本生物学方面，并介绍了通过基因工程方法增强作物植物必需氨基酸的最新进展。

植物需要不断调整它们的转录组来应对各种导致光合作用抑制和细胞能量剥夺的压力。这种调整部分是由与能量相关的转录组的协调重新编程引发的，以减缓光合作用并激活其他促进能量的基因网络。因此，了解属于能量相关途径的基因的应激相关转录网络对于工程胁迫耐受性具有重要意义。在我们小组开发的一种生物信息学方法(称为基因协调)中，我们先前将拟南芥中编码酶和转录因子的基因分为三个簇，在多种生物和非生物胁迫下显示出改变的协调转录行为(Plant Cell, 23,2011,1264)。富集分析进一步表明，控制能量相关代谢的基因作为一个复合网络来应对压力。在本论文中，我们详细描述了在我们之前的论文中描述的这三个簇中属于六个中心能量相关通路的基因的网络关联。我们的研究结果揭示了来自这些途径的基因之间广泛的与压力相关的途径内和途径间相互作用，表明编码参与能量相关代谢的蛋白质的基因以高度协调的方式表达。我们还提供了实例，表明这种方法可以进一步用于阐明耐胁迫的候选基因和同工酶的功能。

植物的莽草酸途径介导初级碳代谢物通过脉络酸盐转化为三种芳香族氨基酸和从它们衍生出的大量次级代谢物。然而，莽草酸通路的调控仍远未被理解。我们假设3-脱氧-d -阿拉伯氨基七聚酸盐7-磷酸合成酶(DAHPS)是一种通过莽草酯途径调节通量的关键酶。为了验证这一假设，我们在转基因拟南芥植株中表达了一个编码反馈不敏感DAHPS的突变细菌AroG基因。使用GC-MS和LC-MS对植物进行了详细的初级代谢和次级代谢分析。我们的结果揭示了细菌AroG表达对莽草酯中间代谢物、苯丙氨酸、色氨酸和广泛的次级代谢物(如苯丙素、硫代葡萄糖苷、生长素和其他激素缀合物)水平的主要影响。我们认为DAHPS是莽草酯途径的关键调节酶。此外，我们的研究结果还揭示了连接植物初级代谢和次级代谢的其他潜在代谢瓶颈。

天门冬氨酸衍生生物合成途径(Asp途径)产生Lys, Thr, Met和Ile的初始步骤由双功能(AK/HSD)和单功能(AK- Lys)天门冬氨酸激酶(AK)酶催化。在这里，我们发现在黑暗和低糖条件下，所有AK基因的转录都是负调控的。通过酵母单杂交和互补染色质免疫沉淀分析，在拟南芥细胞中鉴定出bZIP转录因子ABI5和DPBF4，它们能够与AK/HSD1启动子的含g -box增强子相互作用。在黑暗和低糖条件下，DPBF4和ABI5的转录水平升高与AK基因表达的抑制一致。ABI5的过表达，而不是DPBF4，进一步增加了AK转录抑制。同时，它还增加了天冬酰胺合成酶1 (ASN1)的表达，使天冬酰胺的利用转向天冬酰胺的形成。然而，在abi5或dpbf4突变体和abi5、dpbf4双突变体中，AK表达的抑制得以维持，表明与其他bzip - tf存在功能冗余。在低糖和黑暗环境下，DPBF4融合到SUPERMAN的SRDX抑制域，可以抵消超人的抑制作用，刺激AK的表达。在酵母单杂交实验中，DPBF4- srdx不能识别AK/HSD1增强子序列，但通过酵母双杂交实验估计，DPBF4和ABI5会增加异源二聚体的形成。因此，与DPBF4-SRDX的异二聚可能抑制了冗余功能的bzip - tf与AK基因启动子的结合，从而释放抑制效应。 These data highlight a novel transcription control of the chloroplast aspartate pathway that operates under energy limiting conditions.

任何一对基因的表达模式对不同的胁迫甚至胁迫的不同进展阶段都可能呈负相关、正相关或完全不相关。这使得用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)等经典统计工具来识别这种关系变得困难。因此，需要专门的生物信息学方法，能够识别成对或组基因之间存在正或负表达相关性的线索组。我们在此介绍并讨论了一种生物信息学方法，称为基因协调，它致力于识别基因对之间存在正或负协调的特定或多个线索，并可以进一步合并额外的协调基因，形成大型协调基因网络。我们通过提供一个案例研究来证明这种方法的实用性，在这个案例研究中，我们能够发现能量相关基因网络在响应不同的生物和非生物压力时的不同表达行为。这种生物信息学方法适用于比较治疗和对照的广泛研究，例如各种线索的影响，或突变体和对照野生型基因型之间的表达变化。

氨基酸代谢是生物系统中最重要和最广为人知的网络之一。在植物中，氨基酸有多种与生长有关的功能。氨基酸除了在蛋白质合成中起作用外，还被分解为能量相关的代谢物以及许多次级代谢物，这对植物的生长和对各种胁迫的反应是必不可少的。尽管氨基酸在植物生长中具有核心重要性，但在整个系统中阐明氨基酸代谢的调节，特别是转录调节，仍处于起步阶段。不同的氨基酸是由许多不同的代谢网络合成的，这些代谢网络期望在它们之间具有调节交叉作用，以适当协调它们的相互作用功能，例如与蛋白质结合。然而，单个氨基酸代谢网络也有望与各种全基因组基因表达程序和代谢网络进行不同的交叉作用，就其作为具有不同功能的各种代谢物的前体的功能而言。在本综述中，我们讨论了我们最近的基因组学、代谢和生物信息学研究，这些研究旨在解决这些问题，主要集中在asp家族代谢网络作为主要例子，并将其与芳香族氨基酸代谢网络作为第二个例子进行比较(Angelovici等人在Plant Physiol 151:2058-2072, 2009;Less和Galili在BMC系统生物学3:14,2009;Tzin et al.， Plant J 60:156-167, 2009)。我们对这两个网络的关注是因为:(i)这两个网络都是植物代谢和生长的核心，也是植物生长所必需的大量初级和次级代谢产物的前体; (ii) the amino acids produced by these two networks are also essential to the nutrition and health of human and farm animals; and (iii) both networks conta

水分胁迫环境的形成通常始于降低空气相对湿度(RH)，而土壤水势仍反映有利条件。在低RH(17%)条件下，拟南芥叶片比水导显著增加，水势降低。然而，相对于高RH暴露的植物，气孔性能或渗透叶片调整没有发现可检测到的影响。在本研究中，我们分析了茎部暴露于低RH后2.5和5小时根中的基因表达。在这些条件下，多个具有不同假定生物学作用的基因被鉴定为差异表达;其中有水通道蛋白，部分是在低RH条件下诱导表达的。两种水通道蛋白的转录均集中在根部，维管束周围细胞、分化区细胞和叶毛状体的转录最为明显。我们的研究结果表明，植物根系通过一种传感机制感知来自幼苗的低RH刺激，导致不同的植物转录反应，可能反映了各种生物过程的激活。这种激活可能是预期即将到来的干旱条件的前奏，使植物对未来的水分胁迫情况具有更强的抵抗力。(C) 2009爱思唯尔爱尔兰有限公司 All rights reserved.

关键词:生物化学与分子生物学;遗传学与遗传;医学、研究与实验

关键词:生物化学与分子生物学;遗传学与遗传;医学、研究与实验

本文提出了通过代谢工程提高植物营养价值的复杂问题，以及利用RNAi和微RNA技术克服这一复杂性的潜力，重点介绍了几个关键的例子。它还强调了目前的RNAi和microRNA功能的知识，并讨论了新的RNAi载体及其应用开发的最新进展。RNA干扰(RNAi)和microRNA (miRNA)是2006年诺贝尔生理学或医学奖认可的生命科学领域的突破性发现。这些发现的重要性不仅关系到阐明基因表达的基本调控方面，而且关系到它们在植物和动物中的巨大应用潜力。本文综述了近年来RNAi和microRNA在提高植物营养价值方面的应用，讨论了代谢组学技术在基因工程中的应用，并介绍了相关RNAi和microRNA技术的最新进展。

必需氨基酸蛋氨酸是合成s -腺苷-蛋氨酸(SAM)的底物，SAM将其甲基贡献给许多甲基化反应，并从中生成多胺和乙烯。为了研究蛋氨酸合成在番茄果实成熟过程中的调控作用，我们从番茄中克隆了一个编码胱硫氨酸γ -合成酶(CGS)的cDNA，并分析了其mRNA和蛋白水平。CGS mRNA和蛋白水平在果实“转”期达到峰值，随着果实成熟逐渐下降。值得注意的是，番茄叶片和果实中的CGS mRNA水平均受到蛋氨酸摄食的负面影响，拟南芥不受这一调控，而马铃薯不受此调控。在番茄果实更年期成熟乙烯爆发过程中，乙烯产量升高与CGS mRNA水平升高呈正相关。番茄果实成熟绿色期果皮损伤对乙烯的产生和CGS mRNA的表达均有促进作用。外源蛋氨酸对成熟青果果皮的作用促进了乙烯的生成，表明可溶性蛋氨酸可能是乙烯合成的限速代谢产物。乙烯释放剂乙烯利处理成熟绿番茄果实，诱导CGS基因表达水平升高，说明CGS基因表达受乙烯调控。综上所述，这些结果表明，除了在乙烯合成过程中通过Yang途径进行蛋氨酸部分的循环之外，当诱导乙烯生产的高速率时，可能还需要从头合成蛋氨酸。

植物是人类的主要食物来源，直接或间接地用作牲畜饲料。植物性食物在营养上不平衡，因为它们所含的一些必需代谢产物，如维生素和氨基酸的比例很低，而人类及其相当一部分牲畜无法自行生产这些代谢产物。在人类饮食所需的必需氨基酸中，赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸被认为是最重要的，因为它们在植物性食物中含量很低。在本综述中，我们讨论了利用代谢工程方法提高植物体内必需氨基酸Lys和Met以及硫代谢物水平的方法。我们还重点介绍了一些具体的例子，这些例子需要更深入地了解植物代谢网络的调节，以便在最小限度地干扰植物生长和生产力的情况下，量身定制氨基酸代谢的改善。

RNA干扰(RNAi)是一种古老的基因抑制机制，其机制和生物学功能目前尚不完全清楚。密集的研究集中在开发用于治疗人类疾病和改善植物性状的RNAi技术。然而，将RNAi应用于提高植物的营养价值，为人类和动物提供营养，相关RNAi技术的发展还处于起步阶段。在这里，我们讨论了目前关于植物RNAi功能的知识，以及通过植物RNAi技术的发展来提高植物营养价值的概念和策略。

丛枝菌根(AM)代表了菌根真菌和植物根之间的一种古老的共生关系，它们共同进化出一种精细协调的多阶段相互作用，帮助植物生长。通过对Myc(-)植物突变体的直接筛选，鉴定出一种番茄(Lycopersicon esculentum L. cv。Micro-Tom)突变体M20，其支持菌根前感染(pmi)阶段的能力受损。M20突变体的Myc-表型是一个孟德尔隐性性状，稳定了9代，与先前发现的M161 pmi突变体非等位。M20突变体对分离的AM孢子和定植根具有抗性。与野生型(WT)植物一样，M20根系上的Glomus intraradices appressoria的形成是正常的，但数量显著减少。在体外实验中，与WT相比，M20的渗出物显著降低了孢子的萌发。我们的结果表明，这个新的突变体与M161 pmi突变体具有相似的生理特征，但具有更强的Myc-表型应答抑制作用。

为了阐明Lys合成和分解代谢在确定植物种子中Lys水平方面的相对意义，我们以种子特异性的方式在野生型拟南芥和拟南芥Lys分解代谢途径的敲除突变体中表达了细菌反馈不敏感二氢二吡啶甲酸合成酶(DHPS)。与野生型植物相比，表达细菌DHPS或敲除突变体的转基因植物中游离Lys的含量分别高出约12倍或5倍。然而，这两个性状的组合导致种子游离赖氨酸水平的增效增加了80倍。在表达细菌DHPS的敲除突变体中，游离Lys的显著增加与Glu和Asp水平的显著降低有关，但也与Gin和Asn水平的意外增加有关。这表明种子Lys代谢与酰胺氨基酸代谢之间存在特殊的调控相互作用。值得注意的是，在各种转基因和敲除植物中，与Lys竞争Asp和Glu作为前体的游离Met的水平出人意料地增加了多达38倍。综上所述，我们的研究结果表明，Lys分解代谢在拟南芥种子Lys积累中起着重要的调节作用，并揭示了种子氨基酸代谢的新的调节网络。

mrna的3'裂解和多聚腺苷酸化已经在动物和酵母中进行了详细的研究，但在植物中还没有。为了阐明植物mRNA 3'端形成的调控机制，克隆了3个拟南芥cdna，编码动物蛋白CstF-64、CstF-77和GstF-50的同源物，这3个同源物构成了多聚腺苷酸化机制的裂解刺激因子。实验表明，拟南芥CstF-64同源物的n端结构域以类似于动物蛋白的方式结合rnRNA 3'非编码区。研究还表明，拟南芥CstF-64和CstF-77同源体以与其动物同源体相似的方式强烈相互作用。这些结果表明，这些拟南芥同源物属于核mrna的聚腺苷酸化机制。

含硫氨基酸蛋氨酸是一种营养重要的必需氨基酸，是调节植物生长和对环境反应的几种代谢物的前体。蛋氨酸的生产在很大程度上是由胱硫氨酸-合成酶调节的，它是合成蛋氨酸的第一个特异性酶。这种酶以一种复杂的方式与苏氨酸合成酶(苏氨酸生物合成中的最后一种酶)竞争，以争夺它们共同的底物o -磷酸丝氨酸。新的遗传和分子数据表明，蛋氨酸的合成和分解代谢是由新的转录后和翻译后机制协调调节的，这些机制与胱硫氨酸-合成酶n端部分的调节部分有关。

氨基酸通路是植物代谢工程的重要靶点。由于植物是全球主要的食物供应来源，人们在增加人体食物和动物饲料中绝对需要的“必需”氨基酸含量方面投入了大量的努力。氨基酸工程也用于改善植物生长和抗逆性。植物中氨基酸代谢的许多途径已被阐明，编码大多数酶的基因现已可用。重组基因在转基因植物中的表达，结合遗传学和生物化学方法，对理解氨基酸代谢的调控网络及其与蛋白质的结合做出了重大贡献。这一知识现在被广泛应用于作物的代谢工程，这反映在大量的专利文献中。以必需氨基酸赖氨酸和蛋氨酸为例，探讨了植物氨基酸代谢工程中存在的问题及解决方法。(C) 2002年Elsevier科学。

囊状丛枝菌根真菌在共生的早期阶段通过孢子和营养菌丝感染植物。利用微型番茄(Lycopersicon esculentum)品种Micro-Tom的2500 M2快中子诱变种子，我们分离出一个能够抵抗Glomus intraradices孢子定植的突变体M161。该突变体的myc(-)表型稳定了9代，并被发现分离为单个孟德尔隐性位点。该突变体表现出与野生型植物相似的形态和生长模式特征。光照强度和昼夜温度的改变并没有消除myc(-)特征。接种真菌Glomus mosseae和Gigaspora margarita后，对菌根真菌感染和定植的抗性也很明显。当突变株与接种了丛枝菌根的野生株在同一生长介质中一起生长时，M161的正常定植是明显的。在突变株根际侵染前阶段的评价中，根际G. intraradices的孢子萌发率和附着孢形成率分别比野生型植物低45%和70%。这些结果揭示了在丛枝菌根定殖过程中一个新的基因控制步骤，它由至少一个基因控制，显著减少了菌根感染前阶段的关键步骤。

赖氨酸是一种重要的营养必需氨基酸，其在植物中的含量在很大程度上取决于其合成速度。然而，在某些植物组织和某些胁迫条件下，赖氨酸也通过新的代谢调节机制有效地分解为谷氨酸和其他几种与胁迫相关的代谢物。赖氨酸分解代谢对哺乳动物的大脑功能很重要;谷氨酸的产生可能通过谷氨酸受体调节神经传递信号。植物也具有动物谷氨酸受体的同源物。因此，赖氨酸分解代谢也可能通过这些受体调节各种植物过程。

植物和动物使用cc-氨基己二酸途径分解赖氨酸，酵母和真菌使用完全相同的途径合成赖氨酸。这两类生物在这一途径中还具有结构上不同形式的两种酶，即赖氨酸-氧戊二酸还原酶(赖氨酸-酮戊二酸还原酶;LKR)和糖苷脱氢酶(SDH):在植物和动物中，这些酶连接到一个单一的双功能多肽，而在酵母和真菌中，它们作为独立的实体存在。此外，酵母LKR和SDH具有双向活性，它们的合成代谢功能受到复杂的转录和转录后控制，这显然决定了中间代谢产物的差异积累;在植物中，这两种酶的分解代谢功能的调节尚不清楚。为了阐明植物双功能LKR/SDH酶对分解代谢功能的调控，我们利用酵母作为表达系统，测试了植物LRR/SDH是否也具有类似酵母酶的双向LKR和SDH活性。拟南芥酶补充了酵母SDH零突变体，而不是LKR零突变体。当只编码该双功能多肽的LKR或SDH结构域的缺失突变体在酵母细胞中单独表达时，得到了相同的结果。此外，活性分析表明，拟南芥LKR具有分解代谢活性，但不具有合成代谢活性，其单向活性源于其结构，而非与SDH的连锁。我们的结果表明，LKR的单向活性在调节植物a-氨基己二酸途径的分解代谢功能中起着重要作用。

在哺乳动物和植物中，过量的赖氨酸(Lys)通过糖氨酸分解为α -氨基己二酸半醛和谷氨酸，这是由两个连续的酶，赖氨酸-酮戊二酸还原酶(LKR)和糖氨酸脱氢酶。(SDH)，它们连接在单个双功能多肽上。为了研究这种双功能酶对代谢物通量的控制，我们从发育中的大豆(Glycine max)种子中纯化了它。双功能LKR/SDH的LKR活性对其底物Lys和α -酮戊二酸具有较高的K-m，表明该活性可能是Lys分解代谢的限速步骤。尽管LKR和SDH酶具有连锁作用，但它们具有显著不同的最佳pH值，这表明该双功能酶的SDH活性在体内也可能是限速的。我们之前的研究表明，拟南芥植物既含有双功能的LKR/SDH酶，也含有单功能的SDH酶(G. Tang, D. Miron, J.X. Zhu-Shimoni, G. Galili [1997] Plant Cell 9: 1-13)。在本研究中，我们没有发现大豆种子中存在这种单功能SDH酶的证据。这些结果可能为为什么不同植物种类积累不同的Lys分解代谢产物提供了一个合理的调控解释。

由于必需氨基酸赖氨酸含量极低，许多作物植物的种子被认为是营养价值较低的食物来源。增加种子中赖氨酸含量的尝试受到活跃的分解代谢过程的阻碍，该过程通过糖糖碱将赖氨酸降解为其他代谢物。这个分解代谢过程中的第一种酶是赖氨酸酮戊二酸还原酶(LKR)。我们最近获得的证据强烈表明，赖氨酸通过两种独立的互补机制来维持LKR活性的平衡，从而很好地控制了种子中赖氨酸自身的水平。I) LKR活性在翻译后由赖氨酸通过依赖Ca+2的细胞内信号级联刺激，该信号级联以酶的磷酸化结束，从而防止赖氨酸积累到高水平。LI)随后将赖氨酸结合到酶的活性位点上，可能会暴露LKR表面的磷酸残基，使其更容易被去磷酸化，从而使赖氨酸积累到蛋白质合成所需的足够水平。

从感染AM真菌Glomus intraradices的烟草根(nictiana tabacum cv, Xanthi-nc)中分离到一个差异显示的cDNA克隆(MD17)，该DNA片段在AM建立后表达水平降低，与N. tabacum中两种基本几丁质酶(EC 3.2.1.14) 3'非编码序列的同源性为90%。用烟草几丁质酶基因特异性探针和多克隆抗体检测Northern (RNA)印迹和Western(免疫印迹)，得到了与MD17相似的杂交模式。此外，(1,2,3)噻二唑-7-碳硫酸s -甲酯(BTH)对烟草根中32-kDa几丁质酶基因表达的上调作用在菌根中低于非菌根对照。在组成性表达34-kDa碱性几丁质酶A亚型的转基因菌根植物中，也观察到内源性32-kDa碱性几丁质酶的表达受到抑制。当植物在增加磷酸盐供应的情况下生长时，32-kDa碱性几丁质酶没有受到抑制。这些结果表明，在烟草根中定植和建立G. intraradices的过程中，其基本几丁质酶基因在mRNA水平上表达下调。

在植物和哺乳动物细胞中，过量的赖氨酸通过由两种酶启动的途径分解，即赖氨酸-酮戊二酸还原酶和糖苷脱氢酶。在这项研究中，我们报道了一个编码双功能多肽的拟南芥cDNA，该cDNA包含这两种酶的活性。RNA凝胶印迹分析鉴定出两条mRNA条带——一条包含赖氨酸-酮戊二酸还原酶和糖苷脱氢酶序列的大mRNA和一条仅包含糖苷脱氢酶序列的小mRNA。然而，以赖氨酸-酮戊二酸还原酶或糖苷脱氢酶cDNA序列为探针的DNA凝胶杂交表明，两个mRNA群体明显是由同一基因编码的。为了测试这两种mrna是否具有功能，拟南芥细胞的蛋白质提取物通过阴离子交换层析进行了分离。这种分离揭示了两个独立的峰，一个同时含有洗脱的赖氨酸-酮戊二酸还原酶和糖苷脱氢酶活性，第二个只含有糖苷脱氢酶活性。RNA凝胶印迹分析和原位杂交结果表明，赖氨酸-酮戊二酸还原酶和糖苷脱氢酶基因在发育种子的花器官和胚组织中表达显著上调。我们的研究结果表明，赖氨酸分解代谢受复杂的发育和生理调控，可能在基因表达和翻译后水平上起作用。

在许多细菌中，植物中天门冬氨酸家族途径的第一次酶促反应是由几个天门冬氨酸激酶(AK)的同工酶介导的，这些同工酶受到最终产物氨基酸赖氨酸或苏氨酸的反馈抑制。到目前为止，只有编码苏氨酸敏感ak的cdna和基因从植物中克隆出来。这些都被证明编码含有两种Linked活性的多肽，即AK和高丝氨酸脱氢酶(HSD)，类似于编码苏氨酸敏感的双功能AK/HSD同工酶的大肠杆菌thrA基因。在本报告中，我们描述了一个新的拟南芥cDNA的克隆，该cDNA与编码赖氨酸敏感AK同工酶的大肠杆菌lysC基因高度同源。此外，与细菌赖氨酸敏感的AK相似，目前cDNA编码的多肽是单功能的，不包含HSD结构域。这些观察表明，我们克隆的cDNA编码赖氨酸敏感AK。Southern blot杂交检测到一个与当前cDNA高度同源的基因，另外还有一个同源性较低的基因。独立克隆的另外一个编码赖氨酸敏感AK的拟南芥cDNA证实了这一点(见附文)。Northern blot分析表明，编码该单功能AK cDNA的基因在拟南芥的大部分组织中大量表达。

植物通常含有低比例的几种必需氨基酸，特别是赖氨酸。通过在转基因烟草植株中表达编码细菌二氢二吡啶酸合成酶(DHPS)的嵌合基因，研究了提高植物营养组织和贮藏器官赖氨酸含量的潜力。DHPS是赖氨酸生物合成的关键酶。与植物酶相比，细菌酶对赖氨酸反馈抑制的敏感性要低得多。细菌酶的组成性表达导致营养组织中游离赖氨酸的显著升高，在某些情况下达到总游离氨基酸的40 mol %。此外，赖氨酸的过量生产导致植株表型的改变，包括顶端优势的丧失、株高的降低、浓密的外观、叶片结构的改变和开花时间的延迟。为了研究细菌DHPS提高贮藏器官赖氨酸含量的潜力，我们在转基因烟草植株中以种子特异性的方式表达了这种细菌酶。尽管转基因植物在种子发育过程中增强了赖氨酸的合成，但这种氨基酸在成熟种子中没有过度积累。转基因植物成熟种子中赖氨酸水平低与另一种酶赖氨酸-酮戊二酸还原酶的赖氨酸依赖性刺激有关，赖氨酸-酮戊二酸还原酶可将赖氨酸分解为糖苷。这种刺激被证明是通过Ca2+和蛋白质磷酸化介导的细胞内信号级联作用的。讨论了细菌DHPS单独或与其他基因组合在提高饲料、粮食和块茎作物营养品质方面的潜力。

在原核生物和植物中，必需氨基酸赖氨酸和苏氨酸的合成主要由天门冬氨酸激酶(AK)和二氢二吡啶酸合成酶(DHPS)的反馈抑制调节。为了修改大麦中天门冬氨酸家族通路的通量，并增强相应氨基酸的积累，我们生成了转基因大麦植株，组成性表达编码赖氨酸反馈不敏感形式AK和DHPS的突变大肠杆菌基因。结果表明，初级转化体(T-0)叶片游离赖氨酸增加了14倍，游离蛋氨酸增加了8倍。在DHPS转基因的成熟种子中，游离赖氨酸、精氨酸和天冬酰胺增加了2倍，游离脯氨酸减少了50%，而在分析的两个AK转基因株系的种子中没有观察到变化。与对照种子相比，总氨基酸组成无明显差异。引入的基因在T-1代遗传，酶活性显示AK活性增加2.3倍，DHPS活性增加4.0-9.5倍。DHPS转化体T-1种子的游离氨基酸变化与T-0种子相同。综上所述，天门冬氨酸家族通路可能是通过引入编码反馈不敏感酶的基因进行遗传工程，优先提高赖氨酸和蛋氨酸的水平。

小麦(Triticum aestivum L.)储存的蛋白质在内质网(ER)中隔离后，可以被保留并包装成细胞器内的蛋白质体(PB)或输出到高尔基复合体。为了揭示这些蛋白在内质网中组装和分类的调控信号和机制，我们在爪蟾卵母细胞中表达了一种伽马型麦胶蛋白的野生型和突变型。大量的野生型γ -麦胶蛋白通过高尔基体分泌到培养基中，但仍有相当一部分保留在卵母细胞的内质网中，并聚集成致密的PB。一个仅编码n端序列的缺失突变体被完全保留在卵母细胞内，而另一个仅编码该蛋白c端唯一序列区域的缺失突变体则被完全分泌。γ -麦胶蛋白在内质网内的滞留不能用快速沉淀或组装成不溶性沉积物来解释，因为蛋白质可以在细胞器内相当有效地扩散数小时。相反，γ -麦胶蛋白的突变体，在c端区域缺乏特定的保守半胱氨酸，完全保留在卵母细胞内，无法在ER内扩散。因此，我们假设小麦麦胶蛋白在内质网内的组装和排序是由这些蛋白的N端和c端区域与内质网内驻留蛋白之间的协同相互作用决定的。

大蒜植物(Allium sativum)蒜氨酸酶(EC 4.4.1.4)催化大蒜素的合成，通过各种步骤，包括疏水色谱，从鳞茎中纯化到均质性。分子和生化研究表明，该酶是两个亚基的二聚体，每个亚基为MW 51.5 kDa。以合成的s -烯丙基半胱氨酸亚砜(+异构体)为底物的K-m为1.1 mM，最适pH为6.5，等电点为6.35。这种酶是一种含6%碳水化合物的糖蛋白。得到了完整多肽链的n端序列以及溴化氰裂解后得到的若干肽的n端序列。用两步策略克隆蒜氨酸酶编码的cdna。首先，根据完整多肽n端附近的6个氨基酸片段合成的混合寡核苷酸引物，通过PCR获得cDNA片段(pAli-1-450 bp)。第二步利用pAli-1筛选大蒜lambda gt11和lambda ZAPII cDNA文库，得到两个克隆;一个几乎是完整的长度，第二个是完整的长度。这些克隆表现出一定程度的DNA序列差异，特别是在其3'非编码区，这表明它们是由不同的基因编码的。 The nearly full length cDNA was fused in frame to a DNA encoding a signal peptide from alpha wheat gliadin, and expressed in Xenopus oocytes. This yielded a 50 kDa protein that interacted with the antibodies against natural bulb alliinase. Northern and Western blot analyses showed that the bulb alliinase was highly expressed in bulbs, whereas a lower expression level was found in leaves, and no expression was detected in roots. Strikingly, the roots exhibited an abundant alliinase activity, suggesting that this tissue expressed a distinct alliinase isozyme with very low homology to the bulb enzyme.

研究了必需氨基酸赖氨酸在转基因烟草植物种子中的合成和积累的调控，以种子特异性的方式表达两种反馈不敏感的细菌酶:二氢二吡啶酸合成酶(EC 4.2.1.52)和天门冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)。这两种细菌酶的高水平表达仅导致种子发育中期游离赖氨酸积累略有增加，而接近成熟时游离赖氨酸则下降到对照植物的低水平。为了测试分解代谢的增强是否可能导致游离赖氨酸无法在转基因植物种子中积累，我们分析了赖氨酸-酮戊二酸还原酶(EC 1.5.1.7)的活性，这是一种将赖氨酸分解为糖苷的酶。在对照和转基因植株中，赖氨酸-酮戊二酸还原酶活性的出现时间与二氢二吡啶甲酸合成酶活性的出现时间密切相关，表明赖氨酸合成和分解代谢在种子发育过程中受到协调调节。值得注意的是，转基因植物的赖氨酸-酮戊二酸还原酶活性显著高于对照。两种细菌酶在同一株植物中共表达可显著提高种子白蛋白中赖氨酸和苏氨酸的比例。显然，烟草种子中游离赖氨酸和苏氨酸的正常低稳态水平可能限制了种子蛋白质的合成，而种子蛋白质中这些氨基酸的含量相对丰富。

在高等植物中，必需氨基酸赖氨酸和苏氨酸是由一条共同途径的两个独立分支合成的。这一途径主要由三种关键酶调控，即天门冬氨酸激酶(AK)、二氢二吡啶酸合成酶(DHPS)和高丝氨酸脱氢酶(HSD)，但这些酶是如何协同作用的尚不清楚。为了解决这个问题，我们在转基因烟草植株中表达了高水平的细菌AK和DHPS，它们对赖氨酸和苏氨酸反馈抑制的敏感性远远低于植物。这种细菌DHPS的表达本身会导致赖氨酸的大量过量生产，而只表达细菌AK的植物则会过量生产苏氨酸。当两种细菌酶在同一株植物中表达时，游离赖氨酸的水平远远超过细菌DHPS单独表达的水平。然而，与仅表达细菌AK的植物相比，这种增加伴随着苏氨酸积累的显著减少。我们的结果表明，在烟草植物中，赖氨酸和苏氨酸的合成是在AK、DHPS以及可能的HSD的共同调节下进行的。我们提出赖氨酸和苏氨酸合成的平衡是由DHPS和HSD在共同底物3-天冬氨酸半醛的限制量上的竞争决定的，而3-天冬氨酸半醛的水平又主要由AK的活性决定。讨论了这种分子方法提高植物营养质量的潜力。

人类β -1干扰素(hu-IFNbeta) mRNA的3' au富集区被发现作为翻译抑制元件。在无细胞兔网织红细胞裂解液中研究了该3' au富集序列的翻译调控及其与聚(A)尾的结合作用。富含poly(A)的hu-IFNbeta mRNA (110 A残基)是蛋白质合成的低效模板。然而，当poly(A)束被缩短(11 A残基)或3' AU-rich序列被删除时，翻译效率显著提高，这表明这两个区域之间的相互作用是导致poly(A)-rich hu-IFNbeta mRNA翻译减少的原因。不同hu-IFNbeta mrna的翻译效率差异与其多体分布有很好的相关性。富含poly(A)的hu-IFNbeta mRNA未能形成大的多体，而其具有短poly(A)尾巴的对应物更有效地被招募到大的多体中。当RNA探针同时包含3' au富集序列和长聚(A)尾时，富au序列结合活性降低，支持这两个区域之间的物理关联。RNase H保护实验进一步证明了这种相互作用。我们认为3' AU-rich序列可能通过与poly(A)尾巴相互作用来调控hu-IFNbeta mRNA的翻译。

小麦贮藏蛋白在内质网(ER)中隔离后，要么被保留并包装成细胞器内的蛋白体，要么通过高尔基体运输到液泡。利用酵母异源表达系统对小麦贮藏蛋白的转运和包装过程进行了研究。一种野生型小麦γ -麦胶蛋白，在酵母细胞中表达，主要积聚在内质网内，并沉积在与天然小麦胚乳蛋白体密度相似的蛋白体中。这表明小麦贮藏蛋白含有足够的信息来启动异源系统内质网中蛋白质体的形成。只有少量的-醇溶蛋白被运送到酵母液泡中。当γ -麦胶蛋白缺失突变体在酵母细胞中表达时，缺乏整个n端重复区域，该突变体无法在内质网内启动蛋白体的形成，并被完全运输到酵母液泡中。这有力地表明，内质网内包装成密集蛋白体的信息存在于γ -麦胶蛋白的n端重复区。讨论了利用酵母鉴定小麦贮藏蛋白转运及其在蛋白体中沉积的信号和机制的优势。

在高等植物中，必需氨基酸苏氨酸的合成主要由其生物合成途径中的第一个酶的敏感性调节，天门冬氨酸激酶，对苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制。本研究旨在研究利用基因工程技术提高植物苏氨酸积累的潜力。这是通过在转基因烟草(Nicotiana Tabacum cv Samsun NN)植物的细胞质或叶绿体中表达来自大肠杆菌的突变脱敏天门冬氨酸激酶来解决的。这两种转基因植物都表现出明显的游离苏氨酸过量生产。然而，在叶绿体中表达细菌酶的植物中苏氨酸的积累更高，这表明天门冬氨酸激酶在该细胞器中的区隔化是重要的，尽管不是必需的。叶片苏氨酸过剩与脱敏酶水平呈正相关。表达最高叶天门冬氨酸激酶活性的转基因植物也表现出游离赖氨酸和异亮氨酸水平的轻微增加，这两者与苏氨酸共享一个共同的生物合成途径，但其他游离氨基酸水平没有明显变化。本研究提出了一种提高高等植物苏氨酸限量含量的分子生物学方法。

高等植物中必需氨基酸赖氨酸的合成途径复杂，主要由天门冬氨酸激酶(AK)和二氢二吡啶酸合成酶(DHPS)两种酶的反馈抑制调节。虽然DHPS被认为在这一调控中起着主要作用，但AK的相对重要性尚不清楚。为了研究这一调控，我们在转基因马铃薯植株的叶绿体中表达了一种源自大肠杆菌的DHPS，表达水平是内源DHPS的50倍。细菌酶对赖氨酸抑制的敏感性远远低于马铃薯酶。转基因植株的叶、根和块茎中的DHPS活性明显高于对照植株，对赖氨酸抑制的抗性也明显高于对照植株。此外，这一活动伴随着所有三种组织中游离赖氨酸水平的显著增加。然而，马铃薯叶片赖氨酸过剩的程度明显低于先前报道的表达相同细菌酶的转基因植物叶片，这表明在马铃薯中，AK也可能在赖氨酸生物合成中发挥主要的调节作用。事实上，转基因马铃薯植株中游离赖氨酸水平的升高被证明抑制了赖氨酸敏感的AK活性。我们的研究结果支持了先前的报道，即DHPS是高等植物中赖氨酸合成的主要限速酶，但它们表明还涉及其他植物特异性的调节因子。

小麦贮藏蛋白主要沉积在液泡内的蛋白体中。然而，它们聚集成蛋白体的亚细胞位点和机制尚不清楚。在本报告中，我们提供了两种不同类型的蛋白质体的证据，低和高密度的类型，同时和独立地积累在发育中的小麦胚乳细胞。两种蛋白体中均存在麦胶蛋白，而高分子量谷蛋白主要分布在致密蛋白体中。亚细胞分离和电子显微镜研究显示，小麦同源物免疫球蛋白重链结合蛋白是一种内质网内的蛋白质，存在于致密蛋白体中。这意味着这些是由内质网内储存的蛋白质聚集形成的。结果表明，小麦贮藏蛋白的很大一部分聚集在粗面内质网内形成蛋白体。由于这些蛋白质体太大，无法进入高尔基体，它们很可能被直接运输到液泡中。这一途径可能与已知的高尔基介导的向液泡的转运相一致，在液泡中，储存的蛋白质明显地凝结成内质网后位置的蛋白质体。我们的结果进一步表明，尽管麦胶蛋白通过这两种途径中的任何一种来运输，但高分子量的谷蛋白只使用高尔基旁路途径。

高分子量谷蛋白亚基被认为是小麦(Triticum aestivum)谷蛋白最重要的组成部分之一，但它们的结构和与其他谷蛋白的相互作用仍不清楚。了解这些蛋白在面筋形成中的作用可能有助于分析异种系统中表达的单个野生型和修饰亚基的构象和相互作用。在本报告中，细菌大肠杆菌被用来合成四种天然存在的X型和y型小麦高分子量谷蛋白的Glu-1D位点亚单位，以及这些蛋白质的四部分嵌合体。在细菌中合成的天然亚基表现出与从小麦中提取的高分子量谷蛋白亚基相同的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移特性。野生型和嵌合亚基在十二烷基硫酸钠凝胶中的迁移与基于其分子量的预期不同，这是由于其N端和c端区域的构象性质所致。还原裂解和氧化重组循环的结果与分子间和分子内二硫键的形成模式和比例一致，不同于特定的高分子量谷蛋白物种。嵌合型和野生型蛋白的比较表明，y型亚基的两个c端半胱氨酸通过分子内二硫键连接，这表明这些半胱氨酸在谷蛋白聚合中的作用可能有限。

本研究历时5年(1983-4 ~ 1987-8)，在野生四倍体小麦(Triticum turgidum var. dicoccoides，基因组AABB) Ammiad群体中，研究了高分子量(HMW)谷蛋白亚基的电泳谱变化。利用每年从分布在11个生境的249个确定采样点的单株植物上收集的种子，通过一维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)对这些储存蛋白进行分析。由于植物每年在所有采样点上都不生长，因此共分析了1108份资料。该群体被发现具有高度多态性:基因组A的高分子量谷蛋白位点Glu-Al-1和Glu-Al-2有4个和2个等位基因。Glu-Bl-1和Glu-Bl-2分别有5个和7个等位基因。a基因组等位基因出现4个组合，b基因组等位基因出现12个组合。共有18个基因组间组合(A和B基因型)，其中一些非常罕见，而另一些则大量存在，呈簇状分布在横断面上。这些基因型的空间分布是非随机的，11个生境的基因型频率各不相同。基因型的年度变化主要发生在研究的最后2年，对各种基因型的总频率影响不大。在特定的高分子量谷蛋白基因型与某些生境之间发现了高亲和力。 This affinity may have resulted from a random fixation of specific genotypes in different habitats (founder effect) or, alternatively, from natural selection, thus indicating either linkage between HMW glutenin alleles and adaptive genes (hitchhiking effect) or fitness of some of these allele combinations to specific micro-environments.